Tp 5 Inducción Enzimatica
Páginas: 10 (2490 palabras)
Publicado: 23 de abril de 2012
Trabajo Práctico n°5: Inducción Enzimática
Objetivos
Estudiar las condiciones de de inducción del operón lactosa. Reconstruir en base a los resultados del experimento el mecanismo de regulación del operón por control negativo y positivo.
Introducción
La regulación de los procesos celulares permite a los organismos optimizar el aprovechamiento de los recursos disponibles en cadamomento. Como la realización de estos procesos celulares depende en gran medida de la acción enzimas proteicas, el control de su síntesis es crucial. Uno de estos procesos es la transcripción, los primeros organismos en los que se estudio el control de expresión génica fueron las bacterias, en especial el sistema que regula la expresión de genes necesarios para el metabolismo de la lactosa: undisacárido utilizado como alimento por las bacterias.
El sistema que regula el aprovechamiento de la lactosa como fuente de energía consta de numerosos elementos. El primero de ellos consiste en un grupo de tres genes conectados llamados estructurales, los cuales son lacY, lacZ, y lacA, que codifican respectivamente las enzimas galactosido-permeasa, β-galactosidasa y tiogalactosido-transacetilasa. Laprimera de ellas es un carrier (transportador) que permite la entrada de lactosa a la célula. La segunda hidroliza la lactosa en glucosa y lactosa. Se piensa que la tercera permite la utilización de ciertos sustratos acetilados de la lactosa, pero no se sabe con seguridad. Para estos genes estructurales existe un único y débil promotor. La transcripción de los genes estructurales produce un mRNApolicistrónico.
El sistema también incluye un gen de ubicación cercana a la de los estructurales y expresión constitutiva (siempre prendido) llamado lacI cuyo producto proteico es una proteína represora que se une al operador (región de ADN a la que se une) inhibiendo la transcripción de los genes estructurales por la interferencia que provoca con la RNApol. El represor es tetramérico, poseeun sitio de unión al DNA y un sitio de unión para otra molécula denominada inductor. Cuando el inductor se une al represor se forma un complejo represor-inductor que no tiene afinidad por el ADN. Por lo tanto el complejo se desprende del operador dejándolo libre para la unión de RNApol. De esta manera, el control que realiza el represor es negativo.
Otro elemento del sistema lo constituye unaproteína llamada CRP la cual tiene un sitio de unión a un ligando y otro de unión al DNA. El CRP forma un complejo con el AMP cíclico (producido por la enzima adenilato ciclasa a partir de ATP) y se une a un sitio especifico del promotor haciéndolo más afín a la RNApol. De esta forma, el complejo favorece la transcripción de los genes estructurales y por lo tanto la proteína se denominaactivador. Cuando en el medio hay glucosa la actividad de la adenilato ciclasa se ve alterada siendo imposible sintetizar AMPc apartir del ATP. Esta es otra forma de regulación de la actividad del operon lac, el cual es un control positivo.
Procedimiento:
El experimento consta de dos partes:
a) En la primera parte se incubaron las bacterias con soluciones inductoras o no inductoras deloperón (1ml. De cultivo de una cepa de E. coli):
1- Se tomaron 8 tubos Eppendorf, se los rotuló con el número de tubo y número de grupo y se los colocó en la gradilla. Mediante pipetas rotuladas se procedió de la siguiente manera, según el cuadro:
|Soluc./ tubo |tubo 1 |tubo2 |tubo3 |tubo4 |tubo5 |tubo6 |tubo7 |tubo8 |
|Cultivo|0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 | |
|Solución Fisiológica |0,5 |0,4 |0,4 |0,4 |0,4 |0,3 |0,2 |0,5 |
|IPTG (40mM) | |0,1 | | | | | | |
|Lactosa (5%) | |...
Objetivos
Estudiar las condiciones de de inducción del operón lactosa. Reconstruir en base a los resultados del experimento el mecanismo de regulación del operón por control negativo y positivo.
Introducción
La regulación de los procesos celulares permite a los organismos optimizar el aprovechamiento de los recursos disponibles en cadamomento. Como la realización de estos procesos celulares depende en gran medida de la acción enzimas proteicas, el control de su síntesis es crucial. Uno de estos procesos es la transcripción, los primeros organismos en los que se estudio el control de expresión génica fueron las bacterias, en especial el sistema que regula la expresión de genes necesarios para el metabolismo de la lactosa: undisacárido utilizado como alimento por las bacterias.
El sistema que regula el aprovechamiento de la lactosa como fuente de energía consta de numerosos elementos. El primero de ellos consiste en un grupo de tres genes conectados llamados estructurales, los cuales son lacY, lacZ, y lacA, que codifican respectivamente las enzimas galactosido-permeasa, β-galactosidasa y tiogalactosido-transacetilasa. Laprimera de ellas es un carrier (transportador) que permite la entrada de lactosa a la célula. La segunda hidroliza la lactosa en glucosa y lactosa. Se piensa que la tercera permite la utilización de ciertos sustratos acetilados de la lactosa, pero no se sabe con seguridad. Para estos genes estructurales existe un único y débil promotor. La transcripción de los genes estructurales produce un mRNApolicistrónico.
El sistema también incluye un gen de ubicación cercana a la de los estructurales y expresión constitutiva (siempre prendido) llamado lacI cuyo producto proteico es una proteína represora que se une al operador (región de ADN a la que se une) inhibiendo la transcripción de los genes estructurales por la interferencia que provoca con la RNApol. El represor es tetramérico, poseeun sitio de unión al DNA y un sitio de unión para otra molécula denominada inductor. Cuando el inductor se une al represor se forma un complejo represor-inductor que no tiene afinidad por el ADN. Por lo tanto el complejo se desprende del operador dejándolo libre para la unión de RNApol. De esta manera, el control que realiza el represor es negativo.
Otro elemento del sistema lo constituye unaproteína llamada CRP la cual tiene un sitio de unión a un ligando y otro de unión al DNA. El CRP forma un complejo con el AMP cíclico (producido por la enzima adenilato ciclasa a partir de ATP) y se une a un sitio especifico del promotor haciéndolo más afín a la RNApol. De esta forma, el complejo favorece la transcripción de los genes estructurales y por lo tanto la proteína se denominaactivador. Cuando en el medio hay glucosa la actividad de la adenilato ciclasa se ve alterada siendo imposible sintetizar AMPc apartir del ATP. Esta es otra forma de regulación de la actividad del operon lac, el cual es un control positivo.
Procedimiento:
El experimento consta de dos partes:
a) En la primera parte se incubaron las bacterias con soluciones inductoras o no inductoras deloperón (1ml. De cultivo de una cepa de E. coli):
1- Se tomaron 8 tubos Eppendorf, se los rotuló con el número de tubo y número de grupo y se los colocó en la gradilla. Mediante pipetas rotuladas se procedió de la siguiente manera, según el cuadro:
|Soluc./ tubo |tubo 1 |tubo2 |tubo3 |tubo4 |tubo5 |tubo6 |tubo7 |tubo8 |
|Cultivo|0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 | |
|Solución Fisiológica |0,5 |0,4 |0,4 |0,4 |0,4 |0,3 |0,2 |0,5 |
|IPTG (40mM) | |0,1 | | | | | | |
|Lactosa (5%) | |...
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