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UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Licenciatura en Ciencias Biológicas



Introducción a la Biología Molecular y Celular


TRABAJO PRÁCTICO 1 y 2
“Preparación de DNA plasmídico”
“Electroforesis en geles de agarosa”



-2012-

OBJETIVO

El objetivo del experimento es la purificación de DNA plasmídico -específicamente, pBluescript de altonumero de copias proveniente de una colonia de bacterias de Escherichia Coli- para la posterior visualización de sus moléculas con el método de electroforesis. Luego analizar y distinguir las diferentes formas y longitud en pares de bases de estas moléculas.

INTRODUCCIÓN

Los plásmidos son moléculas circulares extracromosómicas de DNA doble cadena que se encuentran en las bacterias (tambiénen algunos eucariotas). Están en forma superenrollada y su función mas importante es que pueden contener genes que le confieran a la bacterias algunas características adicionales que les permitan sobrevivir en condiciones desfavorables. El DNA plasmídico se diferencia del DNA cromosómico (circular) solamente en el tamaño, ya que químicamente son lo mismo: ambos son DNA. El método de purificación sebasará entonces en esta propiedad: el DNA cromosómico será mucho más denso que el DNA plasmídico y así podremos distinguirlo para extraer solamente este último.

En el segundo tramo del trabajo, como ya mencionamos lo que queremos es visualizar este DNA plasmídico y sus moléculas para lo cual será sometido a una electroforesis en gel de agarosa La agarosa es una sustancia derivada de un alga,que forma redes moleculares de polímeros orgánicos, lo que le confiere su carácter gelatinoso. La electroforesis consiste básicamente en generar el movimiento de partículas cargadas -que en este caso serán negativas por los grupos fosfatos del DNA- al ser sometidas a un campo eléctrico para separar macromoléculas en solución. Nuestro DNA viajará entonces hacia el polo positivo o ánodo. Cabe aclararque la agarosa tiene una superficie porosa que introduce un elemento esencial para que el método funcione: la fuerza de rozamiento. Esta fuerza frena el movimiento de las moléculas de DNA hacia el polo positivo – osea es un factor negativo diferente a su carga,que es un factor positivo- y a su vez su intensidad depende de otros factores mas como son:

• El tamaño de la molécula o longituden pares de bases (pb)
• Su forma
• Características del medio en el cual esta quiere moverse para llegar al polo positivo. En este caso el medio es poroso (agarosa)
• Velocidad de las moléculas

Es así que, al desplazarse a través de este gel de agarosa las partículas estarán constantemente sometidas a dos fuerzas opuestas que determinarán su velocidad:

-La fuerza eléctrica quelas atrae al electrodo (Fe): E (intensidad del campo eléctrico generado) x q (carga misma de las moléculas)
- Fuerza de rozamiento que se opone a su migración.

Ahora bien, como esta última depende de la forma y el tamaño, moléculas distintas se separan por tener velocidades diferentes. Se denomina topoisómeros a distintas formas de la misma molécula, y en el caso del DNA plasmídico, estaspueden ser circular super enrrollada (supercoiled o coled-coil circle o CCC), de circulo abierto (producida por la ruptura de un enlace fosfodiester en una de las hebras, también llamadas open circle o CA) o lineal (si la ruptura se da en las dos hebras de la cadena). Si bien estos topoisomeros tienen el mismo tamaño, su forma es distinta y por ende su migración también. Por lo general, la formasuperenrrollada migra más rápidamente, siguiéndole la de circulo abierto y por ultimo la lineal. También es muy importante que la fuerza de rozamiento sea la producida por el medio viscoso, esta es la clave del experimento. Si pusiéramos el DNA en una solución acuosa la fuerza de fricción seria despreciable a nuestros fines y todas las moléculas se desplazarían sin diferenciarse y sin poder ser...