Traduccion Seminario Método Simple De La Aislación De Arn a Través De La Extracción De Acido Tiocinato De Guanidinio , Fenol Cloroformo
Páginas: 9 (2112 palabras)
Publicado: 19 de octubre de 2011
Método simple de la aislación de ARN a través de la extracción de acido tiocinato de guanidinio , fenol cloroformo
Laboratorio de bioquímica y metabolismo NIDDK instituto nacional de salud Bethesda Maryland 20892 y laboratorio de oncología molecular NCI instituto nacional de salud Frederick Maryland 21701
Recibido el 27 de mayo de 1986
Un nuevo método de aislación total de ARN esdescrito mediante una extracción simple con una mezcla de ácido tiocinato de guanidinio fenol cloroformo. El método provee una preparación pura de ARN subvalorado en alta producción y puede ser completado dentro de 4 h. Es particularmente útil para procesar grandes números de muestras y para la aislación de ARN a partir de cantidades mínimas o ejemplos de tejidos.
Palabras claves: acido nucléico, ARN,ARN mensajero, purificación, expresión de genes, células humanas.
Tiocinato de guanidinio y el cloruro se encuentran entre los desnaturalizantes de proteínas más efectivos (1,2). Como un potente inhibidor de ribonucleasas, el cloruro de guanidinio fue introducido por primera vez como un agente de desproteinización para el aislamiento por cox (3). Desde entonces la extracción de guanidinio seha convertido en el método de selección para la purificación de ARN remplazando la extracción de fenol. Los métodos guanidinios se han utilizado exitosamente por Chirgwin et al (4) para aislar ARN subvalorado de tejidos ricos en ribonucleasa como el páncreas. El protocolo de Chirgwin para la ultra centrifugación de tiocinato de guanidinio lisado a través de un colchón de CsCL se ha convertido enuno de los más usados frecuentemente para la aislación de ARN subvalorado. En el presente informe se describe un nuevo y rápido procedimiento que combina la extracción de tiocinato de guanidinio y fenol-cloroformo. Una combinación de guanidinio y fenol caliente para la aislación de ARN se ha informado desde Feramisco et al (5).
El método que describimos difiere en que éste convierte el métodode fenol-guanidinio caliente en una sola etapa de extracción la cual permite el aislamiento de ARN en 4 h. y proporciona alto rendimiento y pureza de las preparaciones de ARN subvaloradas. Al eliminar el paso del método de ultracentrifugación guanidinio-CSCL, este procedimiento permite el procesamiento simultáneo de un gran número de muestras. Además, este nuevo procedimiento permite larecuperación total de ARN de pequeñas cantidades de tejido o células que lo hace conveniente para los estudios de expresión génica por lo cual solo una cantidad limitada de material biológico está disponible.
Materiales y métodos
Reactivos. La solución de desnaturalización (solución D) era 4 m tiocinato de guanidinio, 25 mM de citrato de sodio, pH 7, 0.5% sarcosil, 0.1 m 2-mercaptoetanol. Paraminimizar la manipulación del tiocinato de guanidinio (peligrosos), se preparó una solución de reserva de la siguiente manera: 250 g de tiocinato de guanidinio (fluka) que fueron disueltos en la botella del fabricante (sin pesar) con 293 ml de agua, 17,6 ml 0.75 M de citrato de sodio, pH7, y 26,4 ml 10% sarcosil a 65° C. Esta solución de reserva puede ser almacenada por lo menos 3 meses a temperaturaambiente. La solución D fue preparada mediante la adición de 0.36 ml de 2-mercaptoetanol/50 ml de solución de reserva. Esta solución puede ser almacenada 1 mes a temperatura ambiente.
El fenol (ácido nucléico de grado, laboratorio de investigación Bethesda) saturado de agua se mantuvo a 4°C hasta 1 mes.
Las preparaciones de ARN a pequeña escala se llevaron a cabo en tubos de polipropilenodesechable de 4- o 15-ml (Falcon, Cat. Nos. 2063, 2059).
Procedimiento experimental. El método ácido guanidinio-fenol-cloroformo (AGPC)2 fue usado para aislar ARN de tejidos y células cultivadas. El siguiente protocolo describe la aislación del ARN de 100 mg de tejido mamario de rata.
Inmediatamente después de remover del animal, el tejido fue picado en hielo y homogenizado (a temperatura...
Laboratorio de bioquímica y metabolismo NIDDK instituto nacional de salud Bethesda Maryland 20892 y laboratorio de oncología molecular NCI instituto nacional de salud Frederick Maryland 21701
Recibido el 27 de mayo de 1986
Un nuevo método de aislación total de ARN esdescrito mediante una extracción simple con una mezcla de ácido tiocinato de guanidinio fenol cloroformo. El método provee una preparación pura de ARN subvalorado en alta producción y puede ser completado dentro de 4 h. Es particularmente útil para procesar grandes números de muestras y para la aislación de ARN a partir de cantidades mínimas o ejemplos de tejidos.
Palabras claves: acido nucléico, ARN,ARN mensajero, purificación, expresión de genes, células humanas.
Tiocinato de guanidinio y el cloruro se encuentran entre los desnaturalizantes de proteínas más efectivos (1,2). Como un potente inhibidor de ribonucleasas, el cloruro de guanidinio fue introducido por primera vez como un agente de desproteinización para el aislamiento por cox (3). Desde entonces la extracción de guanidinio seha convertido en el método de selección para la purificación de ARN remplazando la extracción de fenol. Los métodos guanidinios se han utilizado exitosamente por Chirgwin et al (4) para aislar ARN subvalorado de tejidos ricos en ribonucleasa como el páncreas. El protocolo de Chirgwin para la ultra centrifugación de tiocinato de guanidinio lisado a través de un colchón de CsCL se ha convertido enuno de los más usados frecuentemente para la aislación de ARN subvalorado. En el presente informe se describe un nuevo y rápido procedimiento que combina la extracción de tiocinato de guanidinio y fenol-cloroformo. Una combinación de guanidinio y fenol caliente para la aislación de ARN se ha informado desde Feramisco et al (5).
El método que describimos difiere en que éste convierte el métodode fenol-guanidinio caliente en una sola etapa de extracción la cual permite el aislamiento de ARN en 4 h. y proporciona alto rendimiento y pureza de las preparaciones de ARN subvaloradas. Al eliminar el paso del método de ultracentrifugación guanidinio-CSCL, este procedimiento permite el procesamiento simultáneo de un gran número de muestras. Además, este nuevo procedimiento permite larecuperación total de ARN de pequeñas cantidades de tejido o células que lo hace conveniente para los estudios de expresión génica por lo cual solo una cantidad limitada de material biológico está disponible.
Materiales y métodos
Reactivos. La solución de desnaturalización (solución D) era 4 m tiocinato de guanidinio, 25 mM de citrato de sodio, pH 7, 0.5% sarcosil, 0.1 m 2-mercaptoetanol. Paraminimizar la manipulación del tiocinato de guanidinio (peligrosos), se preparó una solución de reserva de la siguiente manera: 250 g de tiocinato de guanidinio (fluka) que fueron disueltos en la botella del fabricante (sin pesar) con 293 ml de agua, 17,6 ml 0.75 M de citrato de sodio, pH7, y 26,4 ml 10% sarcosil a 65° C. Esta solución de reserva puede ser almacenada por lo menos 3 meses a temperaturaambiente. La solución D fue preparada mediante la adición de 0.36 ml de 2-mercaptoetanol/50 ml de solución de reserva. Esta solución puede ser almacenada 1 mes a temperatura ambiente.
El fenol (ácido nucléico de grado, laboratorio de investigación Bethesda) saturado de agua se mantuvo a 4°C hasta 1 mes.
Las preparaciones de ARN a pequeña escala se llevaron a cabo en tubos de polipropilenodesechable de 4- o 15-ml (Falcon, Cat. Nos. 2063, 2059).
Procedimiento experimental. El método ácido guanidinio-fenol-cloroformo (AGPC)2 fue usado para aislar ARN de tejidos y células cultivadas. El siguiente protocolo describe la aislación del ARN de 100 mg de tejido mamario de rata.
Inmediatamente después de remover del animal, el tejido fue picado en hielo y homogenizado (a temperatura...
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