Transformación De Pglo, Purificación De Plásmido, Y Sds Page

Transformación de pGLO, Purificación de plásmido, y SDS PAGE
Propósito
1. Aprender la técnica de transformación de la proteína de bacteria E. Coli. Con el gen de GFP.
2. Utilizar el métodos de purificación del DNA del plásmido recombinante contenido en una cepa de la bacteria E. Coli,
3. Familiarizarse con las propiedades de DNA plásmido.
4. Analizar resultado de transformación.5. Aprender la técnica de cromatografía de columna del plásmido de pGLO.
6. Aprender hacer electroforesis de proteína.
Introducción
La transformación es el método que consiste en la inserción de uno o más genes en el organismo para cambiar la característica del mismo. Esta ocurre cuando una célula incorpora y expresa un nuevo fragmento del material de DNA nuevo. Este nuevo DNA leda hay organismo una nueva característica que se puede identificar luego de la transformación. En este caso de nuestro laboratorio, el plásmido pGLO lleva el gen GFP que codifica la proteína verde fosforescente y un gen (bla) que codifica una proteína que proporciona a la bacteria resistencia a un antibiótico. El propósito de la bacteria de E. Coli con un plásmido recombinante es la adquisición delmaterial genético.
El método de lisis alcalina consiste en la purificación de un plásmido circulante provenientes de célula bacteriana. El propósito de la utilización de la lisis alcalina consiste en: Remover las células del medio de cultivo en caldo mediante centrifugación, descartar el sobrenadante para reducir contaminación mediante fragmentos de la pared celular del huésped, resuspender lascélulas en un amortiguador, lisar las células con NaOH y SDS, Unión de las hebras de DNA y remoción de contaminación mediante el acetato de potasio, precipitación del DNA de plásmido mediante alcohol, enjuague del material genético con ETOH y resuspender el material genético.

La proteína de GFP es una proteína producida por la medusa Aequorea victoria, que emite bioluminiscencia en la zonaverde del espectro visible. La proteína fluorescente verdosa hace que la medusa brille en la oscuridad. La bacteria pueden transferir plásmido entre ella permitiendo así compartir genes beneficioso y permitir a la bacteria adaptarse al ambiente. La proteína GFP se compone de 238 aminoácidos y tiene un peso molecular de 27000 Dalton. La estructura, en su conjunto, es muy compacta, con el fin deproteger el fluoróforo por reacción con otras moléculas que pueden inactivar. La técnica de SDS PAGE utilizada en el experimento consiste en una técnica analítica semipreparativa en el que se separa biomoleculas según su peso molecular bajo la acción de un campo eléctrico y se obtienen moléculas para estudios inmunológicos. (Laemmli 1.970).
El propósito de este método es que nos permite separar laproteínas haciéndolas pasar por una resina BisAcrilamida, la cual es un agente entre cruzador que genera un polímero sobre el cual se adherirán las proteínas. El SDS es el detergente derivado del ácido de doce carbonos, se une a las proteínas y las desnaturaliza, ya que está cargado negativamente, le aporta carga a las proteínas. Al aplicar un campo eléctrico a la muestra inmersa en la banda concarga, el complejo proteína SDS migrará hacia el polo positivo y se separará según su tamaño ya que se produce pérdida de la estructura de las proteínas, generándose tantas cadenas polipeptídicas como posea la proteína.

Procedimiento
A. La Transformación:
1. Se identificaron microtubos con + pGLO, - pGLO.
2. Se suspendió las celular en 250 μL CaCl2
3. 3 μL pGLO [20 µg / 250 μL /, + pGLO
4. Se encubaron en hielo por 10 minuto
5. Se enfrió a 42 ℃ por 50 segundos.
6. Se puso en hielo por 2 minuto
7. Echaron 250 μL LB
8. Dejo por 10 minuto a temperatura ambiente
9. Echaron 100 μL en las placa correspondiente

B. Purificación de plásmido
I. Concentración de la Bacteria
1. Añadieron 1.5 ml de cultivo.
2. Centrifugaron por 5 minutos...