Vector Enzimas Clonación

Vectores y Enzimas de Restricción
para Clonación de Genes
Fundamento, descripción de la
técnica y aplicación biotecnológica

Tarisha Contreras Aguilar
Andrés Guzmán Aguilar

CLONACION DEL DNA
Comporta la separación de un gen especifico o
de un fragmento de DNA de un cromosoma
mucho mayor y su unión a una pequeña
molécula de DNA portador, para después
replicar este DNA modificado miles omillones
de veces, mediante el aumento del numero de
células y la creación de múltiples copias del DNA
clonado en cada célula.

Vectores
• Los vectores son, esencialmente, moléculas de DNA
transportadoras. Para servir de vector, una molécula de DNA
debe tener unas determinadas características.
Debe poder replicarse
independientemente junto con el
segmento de DNA que transporta

Debe contener algunossitios de
corte para enzimas de restricción,
presentes sólo una vez en el
vector.

El vector de la célula huésped
debe ser fácil de recuperar.
Debe tener algún marcador de
selección

El vector de la célula huéspe
d debe ser fácil de recuperar.

Tipos de Vectores de Clonación
• Por el tamaño del ADN:
– plasmidos: arriba de 5 kb
– Fago lambda (λ): arriba de 50 kb
– BAC (bacterial artificialchromosome): 300 kb
– YAC (yeast artificial chromosome): 2000 kb

• Vectores de Expresión

Tipos de
vectores

Plasmidos

Bacteriófagos

Cósmidos

Plasmidos
• Los plásmidos son moléculas de DNA de doble
cadena extracromosómicas de origen natural que
tienen un origen de replicación (ori+) y que se
replican autónomamente en las células
bacterianas.
• El vector pBR322 fue uno de los primeros
plásmidosdiseñados que se utilizó en DNA
recombinante.

DISEÑO DEL PLASMIDO pBR322
1.
2.
3.

4.

Posee un origen de replicación, en el
cual las enzimas celulares inician la
replicación (10-20 copias por célula)
Contiene dos genes que confieren
resistencia a antibióticos.
Varias secuencias únicas de
reconocimiento para diferentes
endonucleasas suministran los sitios
donde cortar para insertar lassecuencias de DNA foráneo.
Su pequeño tamaño facilita su
entrada en la célula y la
manipulación bioquímica del DNA.

Bacteriófagos lambda
(fago λ)
- Lambda es un bacteriófago
muy utilizado en
experimentos de DNA
recombinante. Se han
identificado y cartografiado
todos los genes de lambda, y
se conoce toda la secuencia
nucleotídica de su genoma.

Los cósmidos
• son vectores híbridos construidosutilizando
partes del cromosoma del fago lambda y de DNA
plasmídico.
• Contienen la secuencia “cos” del fago lambda y
secuencias plasmídicas de replicación y de genes
de resistencia a antibióticos, que permiten
identificar las células huésped que los contienen.

Cromosoma artificial bacteriano.
El factor F es un plásmido que se replica
independientemente y que está implicado en
la transferenciade información genética
durante la conjugación bacteriana.

Puesto que los factores F pueden transportar
fragmentos del cromosoma bacteriano de
hasta 1Mb, han sido diseñados para que
funcionen como vectores de DNA eucariótico

Cromosoma Artificial Bacteriano (BAC)

Cromosomas artificiales de levadura (YAC)
Como los cromosomas de levadura
son grandes, el cromosoma artificial
puede aceptarinsertos de hasta varios
millones de pares de bases

En los YAC pueden insertarse
segmentos de DNA de más de 1
megabasede longitud (1 Mb).
mapas físicos de genomas
eucarióticos, y incluyendo el genoma
humano.

¿Enzimas de restricción
(Endonucleasas)?
• son proteínas cuya función es cortar
las hebras de ADN.

son endonucleasas que clivan
(hidrolizan) en una forma
específica puentes fosfodiéster 3'
- 5'entre pares de bases
adyacentes en la doble cadena
de DNA.

Una vez que la enzima reconoce estos sitios, se
posiciona sobre la molécula de ADN y corta
dentro o en torno de esa secuencia.
cada enzima reconoce un sitio
particular del ADN.

Tipo de Endonucleasas.
Tipo I: cortan el ADN al
azar.*

Tipo II: cortan el ADN en
la misma secuencia de
reconocimiento.
Tipo III: cortan el ADN a
unos 25 pb de...