Vectores

PREGUNTAS DE LOS TRABAJOS DE MICROBIOLOGÍA APLICADA, CURSO 2007-2008 GRUPO I 1- VECTORES DE EXPRESION EN E.coli. PROMOTORES INDUCIBLES Y CONSTITUTIVOS, PROTEÍNAS DE FUSIÓN. 1.- Concepto de vector, principales tipos y diferencias fundamentales entre ellos. Un vector es todo plásmido, cósmido o fago que incluye el gen de interés dentro de la célula hospedadora, junto a secuencias que aseguran sureplicación y, en ocasiones, su expresión dentro de la misma. Existen diversos tipos de vectores según su finalidad: vectores de clonación y vectores de expresión. Diferencias fundamentales entre vectores de expresión y vectores de clonación: - Los vectores de clonación sirven para la multiplicación del gen de interés y su conservación en la población de células hijas derivadas de la célulahospedadora inicial. Por el contrario, los vectores de expresión se caracterizan porque, aunque también sirven para la clonación de genes concretos, su objetivo principal es conseguir la expresión de los mismos para obtener su producto génico (diferentes tipos de RNAs, proteínas). - Todo vector de clonación debe poseer uno o varios sitios de restricción, únicos para las principales endonucleasas, para lainclusión del inserto de DNA; marcadores genéticos de selección, que permitan diferenciar qué células han incorporado el vector y cuáles no; y un origen de replicación, que es el sitio de unión de la DNA polimerasa. Por su parte, los vectores de expresión, además de todos los elementos propios de un vector de clonación, poseen otros que posibilitan la expresión del gen; entre ellos, un promotorespecífico que permite la transcripción del mismo por la RNA polimerasa del hospedador. Además, como en la mayoría de los casos el producto de interés es una proteína, el vector también ha de contar con secuencias que posibiliten la traducción del RNA generado. 2.- Nombre los principales elementos de un vector de expresión para la síntesis de proteínas en Escherichia coli. Defina promotor ydiferencie entre promotores fuertes/débiles; inducibles/constitutivos:

Principales elementos de un vector de expresión en E.coli: Origen de replicación Marcador genético de selección Sitio/s de clonación simple o múltiple (MCS o polilinker)

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Promotor Operador Gen/es de la/s proteína/s reguladora/s Secuencias de inicio y fin de la transcripción (terminador) RBS (Ribosome Binding Site) osencuencia Shine - Dalgarno Codones de inicio de la tradución (ATG, en el vector) y codón de paro de la traducción

El promotor es la secuencia de DNA que regula la expresión del gen o del operón que se encuentra bajo su control, gracias a su interacción con la RNA polimerasa. Dos tipos de promotores: - En función del nivel de expresión: Promotores fuertes / débiles Un promotor fuerte es aquel que, porposeer una gran afinidad por la RNA polimerasa, permite formar una gran cantidad de RNA que, en última instancia, se traducirá en proteínas (cuando su expresión esté permitida). Por el contrario, un promotor débil posee una baja afinidad por la RNA polimerasa, y en consecuencia, bajo su control la expresión del gen es mucho menor. - En función del mecanismo de control: Promotores constitutivos /regulables Se dice que un promotor es constitutivo cuando permite que la expresión del gen que está bajo su control se dé de forma continua. Por el contrario, los promotores regulables sólo permiten la expresión de los genes que controlan cuando su producto es esencial. Pueden ser inducibles si sólo permiten la expresión del gen o genes que regulan tras un estímulo determinado (en presencia de lascondiciones de inducción), y reprimibles, cuando la expresión de los genes bajo su control es continua y sólo se detiene tras un determinado estímulo (bajo las condiciones de represión) tras un estímulo o bajo determinadas condiciones. 3.- ¿Qué es una proteína de fusión?, ¿a qué nivel y cómo se construye?. Nombre las principales aplicaciones de las proteínas de fusión. Las proteínas de fusión...