Biuret y bradford

Métodos para la cuantificación de proteínas

Emilio Fernández y Aurora Galván*

Depto. Bioquímica y Biología Molecular, Campus Rabanales , Edif. Severo Ochoa, 14071 Córdoba

RESUMEN

En esta práctica se utilizaran dos métodos para la cuantificación de proteínas: Biuret y Bradford. Para cada uno de los métodos se realizaran: una curva estándar, el cálculo del coeficiente de extinción y elrango de sensibilidad. Se realizará la cuantificación de dos muestras problemas de baja y alta concentración, respectivamente, y se discutirá las ventajas e inconvenientes de cada uno de los métodos.

Título corto: Cuantificación de proteínas

Palabras clave: cuantificación de proteínas, Biuret, Bradford, BCA

Abreviaturas: BCA: ácido bicinconínico

1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS

1.1Métodos para la cuantificación de proteínas: ventajas e inconvenientes

Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica de rutina básica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta, cuando se quiere conocer la actividad específica de una preparación enzimática, para el diagnóstico de enfermedades, así como para otros muchos propósitos.Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se basan en: a) la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV, b) para la formación de derivados químicos, o c) la capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes. En la Tabla I se recogen los métodos más usados así como sus respectivas sensibilidades. Cada uno de estos métodostiene sus ventajas e inconvenientes, las principales se recogen en la Tabla II.


 
Tabla I. Principales métodos para la cuantificación de proteínas y sus rangos de sensibilidad

Método Rango de sensibilidad (g) Coeficiente de extinción o Cálculo de la concentración
Métodos de Absorción
A280
A205
A280 - A260
A235 - A280
A224 - A236A215 - A225
100-3000
3-100
100-3000
25-700
5-180
2-45

280 = 1 mL/mg cm
205 = 31 mL/mg cm
Proteína (mg/mL) = (1.55A280 – 0.76A260)
Proteína (mg/mL) = (A235 – A280)/2.51
Proteína (mg/mL) = (A224 – A236)/0.6
Proteína (g/mL) = 144(A215 – A225)
Métodos Derivados Colorimétricos
Biuret 545 =
Lowry 25-100 a 500 nm
2-30 a 660 nm
1-2 a 750 nm Usar curvaestándar
Bradford 595 =
BCA 0.5- 10 Usar curva estándar
Métodos Derivados Fluorimétricos
o-ftalaldehido 1-5 excitación a 340 nm
emisión a 475 nm Usar curva estándar


Tabla II. Principales métodos para la cuantificación de proteínas, principales ventaja e inconvenientes

Método Ventajas Inconvenientes
Métodos de Absorción
No se pierden las muestrasInterfieren muchos compuestos que absorben en el UV

Métodos Derivados Colorimétricos
Biuret Bastante específico para proteínas
Muestra pocas interferencias
Es barato Tiene poca sensibilidad
Lowry Tiene bastante sensibilidad
No todas las proteínas reaccionan igual
Mustra muchas interferencias como detergentes no iónicos, sulfato amónico etc.
Bradford Muysensible Muestra interferencias con detergentes
BCA Es el método mas sensible
Es el que muestra menos interferencias Es más caro
Métodos Derivados Fluorimétricos
o-ftalaldehido Muy sensible La interferencia de aminas contaminantes en la muestra
No todas las muestras reaccionan igual


1.2. Método de Biuret

Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy baja y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy...