Enzimologia

“Enzimología I”



* Introducción:
Las enzimas tienen gran poder catalítico, poseen un elevado grado de especificidad respecto a sus sustratos, aceleran espectacularmente las reacciones químicas específicas y funcionan en soluciones acuosas en condiciones muy suaves de temperatura y pH. [1] Con la excepción de un pequeño grupo de moléculas de RNAcatalítico, todas las enzimas son proteínas, su actividad catalítica depende de la integridad de su conformación proteica nativa. Si una enzima de desnaturaliza o se disocia en subunidades por el efecto de la temperatura aumentada, la actividad catalítica suele desaparecer por la ruptura de enlaces como puentes de hidrógeno, lo que por otro lado pierde su conformación nativa. Si se descompone unaenzima en sus aminoácidos constituyentes, siempre se destruye su actividad catalítica. [2]
Por otra parte el almidón es un polisacárido formado por 2 tipos de cadena: amilasa (lineal), que presenta sólo enlaces α 1-4 y amilopectina (ramificada), con enlaces α 1-4 y α 1-6. El almidón se reconoce químicamente por el color azul intenso que desarrolla en presencia de yodo.
En los animales superioresla digestión de los alimentos, como el almidón se inicia en la boca, la saliva contiene una enzima llamada amilasa salival, esta es capaz de actuar sobre el almidón y el glucógeno rompiendo los enlaces glicosídicos α 1-4 de los polisacáridos, las moléculas que resultan entonces son del disacárido de maltosa, maltotriosa y glucosa. [3]
Las enzimas tienen un pH óptimo o un intervalo de pH en el quesu actividad es máxima, a valores superiores o inferiores de pH su actividad disminuye. Esto no es sorprendente dado que algunas cadenas laterales de aminoácidos pueden actuar como ácidos o bases débiles que desarrollan funciones críticas en el sitio activo de la enzima y que dependen del mantenimiento de un cierto estado de ionización, mientras que en otras zonas de la proteína algunas cadenaslaterales ionizadas pueden jugar un papel esencial en las interacciones que mantiene la estructura de la proteína (eliminar un protón de un residuo es eliminar una interacción esencial para la estabilización de la conformación activa de la enzima), por lo que la actividad enzimática se mide en presencia de amortiguadores de pH.[4]
* Objetivos:
* Manipular muestras biológicas.
* Conocerlas actividades de una enzima (amilasa salival), en muestras biológicas.
* Demostrar el resultado que tiene en la actividad de una enzima la variación de pH y el cambio de temperatura.
* Materiales y métodos:
Realizar una preparación enzimática con 30 a 40 mL de agua destilada enjuagado en la boca durante un minuto, para luego filtrar.
a) Efecto de la temperatura sobre la hidrólisisenzimática del almidón.
Enumerar 5 tubos de ensayo, a 4 de ellos agregar 2 mL de la preparación enzimática, 1 mL de solución tampón fosfato (pH 7.0), 1 mL de NaCl al 0,9% p/v y 2 mL de la solución almidón al 1% p/v. Al quinto tubo agregar 3 mL de NaCl, 1 mL de tampón fosfato y 2 mL de almidón. Luego se incubaran en las siguientes condiciones: el primer tubo a 0°C (sobre hielo), el segundo tubo abaño de agua hirviendo (100°C) Arquimed modelo YCW-04M, el tercer tubo a temperatura ambiente (25°C), el cuarto y quinto tubo incubar a 37°C en baño termoregulado (Precision water bath, N-Biotek modelo NB-301). Después de 15 minutos adicionar 2-3 gotas de lugol (reactivo utilizado para identificar polisacáridos, dando una coloración violeta), mezclar y observar.
b) Efecto del pH sobre laactividad de la amilasa salival
Enumerar 4 tubos de ensayo, a cada uno de ellos agregar 1 mL de NaCl al 0.9% p/v, 2 mL de almidón al 1% p/v, adicionar 1mL de tampón fosfato: al tubo 1 con pH 5, al segundo tubo pH 7, al tercer y cuarto tubo pH 9. Luego agregar a los 3 primeros tubos de ensayo 2 mL de la preparación enzimática. Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos para luego...