microbiologia

Universidad del Zulia
Facultad Experimental de Ciencias
Departamento de Biología
Genética
Nombre: Dairis Montero C.I: 20296121 Fecha: 19-01-15
Práctica 6: EXTRACCION DE ADN PLASMIDICO

Objetivos:
1. Adquirir conocimientos teóricos sobre extracción de DNA plásmidico, enzimas de restricción, ligación, y transformación.
2. Observar el DNA plásmidico contenido en una cepa de labacteria E. coli mediante electroforesis en gel de agarosa a traves de un transiluminador de luz UV.
Materiales y métodos
Para realizar el Protocolo de Ebullición miniprep se tomó cultivos de Escherichia coli, se dispenso en tubos eppendorf estériles y se centrifugo por 1,5 min. Luego se eliminó todo el sobrenadante. Se añadió 110 µl de STET más lisozima. Posteriormente se Colocó en baño enebullición por 45 seg. Se volvió a Centrifugar por 15 min, a temperatura ambiente se realizó la extracción de todo el pellet con un palillo. Se añadió 110 µl de isopropanol, se mezcló y dejo reposar por 5 min, se Centrifugo 15 min, eliminando todo el sobrenadante. Se dejó secar un poco, y resuspender en 20 µl de buffer TE. Se Colocó 3 µl de muestra en gel de agarosa al 0,8% por 1 hora a 100 voltios yteñir con bromuro de etidio. Y se realizó las observaciones a través del transiluminador.
Resultados y Discusiones:
Los plásmidos son moléculas de DNA circular, extracromosómica, que a menudo lleva información genética, que se replica independientemente del cromosoma huésped.1 estas estructuras tienen uno o más genes, a menudo muy pocos. En general, los plásmidos se clasifican de acuerdo con lainformación genética especificada por su DNA.2 Están presentes normalmente en bacterias, y en algunas ocasiones en organismos eucariotas como las levaduras. Su tamaño varía desde 3 a 10 kb. A diferencia del ADN cromosomal, los plásmidos no tienen proteínas asociadas.
El tipo de genes que portan los plásmidos es variado, tratándose generalmente de genes que aportan ventajas adaptativas a la bacteriaque los porta: genes de resistencia a antibióticos, genes de producción de sustancias tóxicas para otras bacterias o genes que codifican enzimas útiles para degradar sustancias químicas.3
El DNA de un plásmido recombinante presente en una bacteria para efectos de la practica se utilizo Escherichia coli se aísla por un método rápido y sencillo (“miniprep”) que consiste en lisis bacteriana,precipitación de proteínas y DNA genómico, y finalmente precipitación del DNA plasmídico. El objetivo es obtener suficiente cantidad del DNA para su análisis posterior mediante electroforesis.
La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de éstas en un campo eléctrico, se usa en una gran mayoría en la materia del ADN recombinante ya que nos permite saber la cargaque poseen los polipéptidos, y separar los diferentes polipeptidos resultantes de las variaciones del experimento del ADN recombinante. La variante de uso más común para el análisis de mezclas de proteínas o de ácidos nucleicos utiliza como soporte un gel, habitualmente de agarosa o de poliacrilamida. Los ácidos nucleicos ya disponen de una carga eléctrica negativa, que los dirigirá al polopositivo, mientras que las proteínas se cargan al unirse con sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de una manera dependiente de la masa molecular de la proteína. Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico, éstas se moverán y deberán ir pasando por la malla del gel (una red tridimensional de fibras cruzadas), por lo que las pequeñas se moverán mejor, másrápidamente. Así, las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán cerca del lugar de partida. La electroforesis de ADN fue, y sigue siendo, una herramienta de importancia primordial en el desarrollo de las técnicas del ADN recombinante o ingeniería genética.4
La composición y la fuerza ionica del buffer afectan la migración del ADN. Si la concentración de iones fuera excesivamente...