Practicas laboratorio de microbiologia

PRACTICA Nº: 5.-AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE SALMONELLA.


1.OBJETIVOS
- Identificar la especie de Salmonella que tiene nuestra mayonesa.

2.FUNDAMENTO TEÓRICO
Salmonella, es un género bacteriano, perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, integrada por microorganismos de forma bacilar, no esporulados, habitualmente móviles mediante flagelos perítricos, aunque existen mutantesinmóviles. El serotipo Salmonella pollorum-gallinarum es siempre inmóvil.

Gram negativos, aerobio, anaerobios facultativos, fermentan la glucosa con producción de gas. No fermentan la lactosa. Reducen los nitratos a nitritos. Son cítocromo oxidasa negativos.
Forman colonias típicas sobre medios de cultivo sólidos y poseen características bioquímicas y serológicas definidas que se utilizarán parasu confirmación.

3.MATERIAL Y REACTIVOS
Material:
Matraces erlenmeyer
Tubos de ensayo de 16x160 mm
Gradillas
Pipetas estériles de 10 y 1 ml
Placas de Petri de 90 mm
Estufa de cultivo
Asa de siembra
Portaobjetos
Baño termostátizado
Caldos, medios de cultivo y reactivos:
Agua de peptona tamponada (BPW)
Caldo de enriquecimiento selectivo líquido, tetrationado-bilis-verde brillante(Müller-Kauffmann)
Caldo Rappaport-Vassiliadis-peptona de soja (RVS)
Caldo de enriquecimiento selectivo líquido, selenito cistina
Medio de aislamiento diferencial selectivo, agar verde brillante-rojo fenol (BGA)
Agar-xilosa-lisina-desoxicolato (XLD)
Agar Hektoen (HE)
Agar Kliguer Iron
Agar Fenilalanina
Reactivo de Kovacs
Rojo de metilo
Voges-Proskauer
API 20
Tiras oxidasa
Mirar anexo Icon la composición de los medios de cultivo.

4.PROCEDIMIENTO
Fases del aislamiento e identificación
• Preenriquecimiento en medio líquido no selectivo: En esta etapa se logra la revivificación de las Salmonellas lesionadas, se incrementa su vitalidad y se adquieren las condiciones fisiológicas adecuadas para su perfecto desarrollo. El medio de elección es el agua de peptona tamponada (APT) que,al mantener un pH constante, favorece el desarrollo de las Salmonella. Por otra parte, la peptona y los fosfatos revitalizan el germen.

• Enriquecimiento en medios líquidos selectivos: Con ello se estimula y favorece el crecimiento de las Salmonella y se restringe la proliferación de la flora competitiva.

• Aislamiento diferencial sobre medios sólidos selectivos: En este aislamientodiferencial se restringe, aún más, el crecimiento de la flora competitiva y se estimula el de las Salmonella. Por otra parte, la composición de los distintos medios permite el crecimiento de colonias con aspecto característico en cada uno de ellos.

•Confirmación bioquímica de las colonias sospechosas.

• Confirmación serológica de las colonias sospechosas.





1)PREENRIQUECIMIENTO EN MEDIOLÍQUIDO NO SELECTIVO.

Pesar asépticamente 25 ± 1g de alimento e introducirlo en bolsa Stomacher estéril. Añadir respectivamente 225 ml de APT. Obtenemos así la dilución 1:10.
Mezclar bien e incubar a 37 ⁰ ± 1⁰C durante 16-20 horas.

2)ENRIQUECIMIENTO EN MEDIOS LÍQUIDOS SELECTIVOS.

Agitar el cultivo de preenriquecimiento y sembrar, con ayuda de una pipeta estéril los siguientes mediosselectivos:
1 ml de cultivo de preenriquecimiento en 10 ml de Caldo selenito-cistina incubando a 37 ⁰C ± 1⁰C durante 18-24 horas. En el caldo Selenito-Cistina, el selenito inhibe el crecimiento de gran parte de la flora competitiva sin afectar a Salmonella, Shigella, Pseudomonas y Proteus. La cistina favorece el crecimiento de Salmonella.
0´1 ml de cultivo de preenriquecimiento en 10 ml de caldoRappaport-Vassiliadis peptona de soja (RVS), incubando a 42 ± 1⁰C durante 18-24 horas. El verde de malaquita inhibe el crecimiento de la flora competitiva, pero no el de Salmonella. Los fosfatos monopotásico y dipotásico mantienen inalterable el valor de pH durante el almacenamiento del medio. La concentración de cloruro magnésico es óptima para lograr un buen enriquecimiento del caldo y favorecer...