Reaccion en cadena de polimerasa
Páginas: 19 (4539 palabras)
Publicado: 11 de diciembre de 2013
I. INTRODUCCIÓN
Pocos descubrimientos del complejo mundo científico actual pueden ser considerados realmente revolucionarios. Sin embargo, cuando ocurren se transforma el modo en que se piensa y trabaja en el laboratorio.
Aunque el progreso en las diferentes ramas de la ciencia parece ser lento y su evolución resulta una letanía de «paso a paso», en el caso de la biología molecular hasucedido lo contrario. Esta disciplina ha sido afortunada con grandes cambios en tiem pos relativamente cortos.
Una época nutrida de dichos cambios fue la dé cada de 1970, en la que se produjo un gran núme ro de descubrimientos, como el de las enzimas de restricción, la donación de genes en plásmidos y fagos, y las técnicas de hibridación en filtro para ADN y ARN, conocidas como "Southern" y"Northern blot", respectivamente; así como las invenciones de las técnicas de secuenciación química y enzimática para el ADN. Otro salto tecnológico ocurrió en 1983, cuando Kary Mullis desarrolló una nueva técnica que hizo posible la síntesis de grandes cantidades de un fragmento de ADN sin tener que clonarlo: la reacción en cadena de la polimerasa (conocida como PCR por sus siglas en inglés). Estatécnica es considerada la más revolucionaria del último cuar to del siglo. Con ésta se consigue copiar millo nes de veces, en un par de horas, una secuencia predeterminada, dentro de una mezcla de ADN tan compleja como el propio genoma humano, donde la secuencia de interés representa tan sólo una diez millonésima parte.
II. DEFINICIÓN
La PCR es un método in vitro de síntesis de ADN con el que unsegmento particular de éste es específica mente amplificado al ser delimitado por un par de cebadores o iniciadores que lo flanquean. Su co piado se logra en forma exponencial a través de repetidos ciclos de diferentes periodos y temperatu ras de incubación en presencia de una enzima ADN polimerasa termoestable. Así se obtienen en cues tión de horas millones de copias de la secuencia deseada delADN.
La PCR es una técnica de biología molecular al tamente específica, rápida, sensible y versátil para detectar cantidades ínfimas de un cierto ADN espe cífico, posibilitando su fácil identificación y prescin diendo del uso de radioisótopos, indispensables antes de su invención.
Al principio, su inventor enfrentó dos problemas fundamentales: uno era que en cada ciclo había que añadir laenzima ADN polimerasa, ya que ésta se inactivaba con las temperaturas tan altas deman dadas para desnaturalizar el ADN y exponer las ba ses nitrogenadas de sus nucleótidos. Otro inconve niente era que había que hacerlo manualmente en tres baños mantenidos a las diferentes temperaturas requeridas, pasando rápidamente la muestra de un baño al otro y luego al último, repitiendo esto varias decenas deveces. El descubrimiento de una bacteria (Thermus aquaticus) que vive en aguas terma les junto a geissers a 75°C, la cual tiene una ADN polimerasa que fun cionaba bien a altas temperaturas (72°C) e incluso es estable a 94°C, supuso un gran avance, ya que sólo tenía que ser añadida al principio y se mantenía activa durante todo el proceso.6 Esto, junto con el diseño de los termocicladores o aparatosque consisten en un bloque que puede ser programado para calentarse y enfriarse rápidamente en determi nados tiempos, condujo a la automatización total del proceso.
III. FUNCIONAMIENTO
La reacción consta, por lo regular, de una treintena de ciclos repetitivos conformados cada uno de tres pasos: el primero consiste en la ruptura de los puen tes de hidrógeno del ADN para desnaturalizarlo, paralo que se incuba a una temperatura de alrededor de 95°C, por un minuto. Este paso expone las bases nitrogenadas del ADN blanco. En el segundo ocu rre la hibridación de las cadenas desnaturalizadas del ADN blanco con los denominados cebadores o iniciadores (ADN sintético de hebra sencilla), a una temperatura que facilita el apareamiento de las ba ses nitrogenadas complementarias de ambas clases...
Pocos descubrimientos del complejo mundo científico actual pueden ser considerados realmente revolucionarios. Sin embargo, cuando ocurren se transforma el modo en que se piensa y trabaja en el laboratorio.
Aunque el progreso en las diferentes ramas de la ciencia parece ser lento y su evolución resulta una letanía de «paso a paso», en el caso de la biología molecular hasucedido lo contrario. Esta disciplina ha sido afortunada con grandes cambios en tiem pos relativamente cortos.
Una época nutrida de dichos cambios fue la dé cada de 1970, en la que se produjo un gran núme ro de descubrimientos, como el de las enzimas de restricción, la donación de genes en plásmidos y fagos, y las técnicas de hibridación en filtro para ADN y ARN, conocidas como "Southern" y"Northern blot", respectivamente; así como las invenciones de las técnicas de secuenciación química y enzimática para el ADN. Otro salto tecnológico ocurrió en 1983, cuando Kary Mullis desarrolló una nueva técnica que hizo posible la síntesis de grandes cantidades de un fragmento de ADN sin tener que clonarlo: la reacción en cadena de la polimerasa (conocida como PCR por sus siglas en inglés). Estatécnica es considerada la más revolucionaria del último cuar to del siglo. Con ésta se consigue copiar millo nes de veces, en un par de horas, una secuencia predeterminada, dentro de una mezcla de ADN tan compleja como el propio genoma humano, donde la secuencia de interés representa tan sólo una diez millonésima parte.
II. DEFINICIÓN
La PCR es un método in vitro de síntesis de ADN con el que unsegmento particular de éste es específica mente amplificado al ser delimitado por un par de cebadores o iniciadores que lo flanquean. Su co piado se logra en forma exponencial a través de repetidos ciclos de diferentes periodos y temperatu ras de incubación en presencia de una enzima ADN polimerasa termoestable. Así se obtienen en cues tión de horas millones de copias de la secuencia deseada delADN.
La PCR es una técnica de biología molecular al tamente específica, rápida, sensible y versátil para detectar cantidades ínfimas de un cierto ADN espe cífico, posibilitando su fácil identificación y prescin diendo del uso de radioisótopos, indispensables antes de su invención.
Al principio, su inventor enfrentó dos problemas fundamentales: uno era que en cada ciclo había que añadir laenzima ADN polimerasa, ya que ésta se inactivaba con las temperaturas tan altas deman dadas para desnaturalizar el ADN y exponer las ba ses nitrogenadas de sus nucleótidos. Otro inconve niente era que había que hacerlo manualmente en tres baños mantenidos a las diferentes temperaturas requeridas, pasando rápidamente la muestra de un baño al otro y luego al último, repitiendo esto varias decenas deveces. El descubrimiento de una bacteria (Thermus aquaticus) que vive en aguas terma les junto a geissers a 75°C, la cual tiene una ADN polimerasa que fun cionaba bien a altas temperaturas (72°C) e incluso es estable a 94°C, supuso un gran avance, ya que sólo tenía que ser añadida al principio y se mantenía activa durante todo el proceso.6 Esto, junto con el diseño de los termocicladores o aparatosque consisten en un bloque que puede ser programado para calentarse y enfriarse rápidamente en determi nados tiempos, condujo a la automatización total del proceso.
III. FUNCIONAMIENTO
La reacción consta, por lo regular, de una treintena de ciclos repetitivos conformados cada uno de tres pasos: el primero consiste en la ruptura de los puen tes de hidrógeno del ADN para desnaturalizarlo, paralo que se incuba a una temperatura de alrededor de 95°C, por un minuto. Este paso expone las bases nitrogenadas del ADN blanco. En el segundo ocu rre la hibridación de las cadenas desnaturalizadas del ADN blanco con los denominados cebadores o iniciadores (ADN sintético de hebra sencilla), a una temperatura que facilita el apareamiento de las ba ses nitrogenadas complementarias de ambas clases...
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