actividad enzimatica



Objetivos:
1) cuantificar la actividad de una preparación de fosfatasa ácida comercial.
2) observar el efecto de la cantidad de enzima y sustrato en la velocidad de una reacción catalizadaenzimáticamente.

Introducción
Para que una molécula de reactivo o sustrato pueda llegar a transformarse en una molécula de producto, P debe poseer una cantidad de energía mínima para alcanzar elEstado de Transición SP. La cantidad de energía necesaria se llama energía de activación.
La velocidad de la reacción S --- P depende del número de moléculas de S que alcanzan el estado de transiciónpor unidad de tiempo. Hay dos formas de aumentar la velocidad de reacción: Una es elevando la temperatura, la otra es disminuyendo la EA.
A temperaturas fisiológicas pocas, o quizá ninguna de lasreacciones del metabolismo intermediario transcurrirían a una velocidad suficiente que permitiese a las células crecer y mantenerse. Las células vivas pueden existir en condiciones ambientalesrelativamente suaves, porque poseen ENZIMAS: Catalizadores biológicos que disminuyen selectivamente la energía de activación de las reacciones químicas vitales.
Las enzimas no afectan ni a la ∆G ni a la Keqde una reacción; únicamente aumentan la velocidad con la que una reacción se aproxima al equilibrio.
La fosfatasa ácida cataliza la hidrólisis de ésteres fosfato (monoésteres fosfóricos ypirofosfatos). Para poder cuantificar su actividad biológica se utiliza un sustrato no biológico, el p-nitrofenil fosfato (PNFP).



PNFP PNFP

Para determinar la velocidad inicial, se mide la liberación de PNF. El PNF en medio alcalino se ioniza, quedando la molécula con una carga negativa deslocalizada. El compuesto resonantees de color amarillo y presenta un máximo de absorción a 400 nm.





Procedimiento:

1) Se prepararon las mezclas de reacción (sin enzima!!!) en tubos eppendorf (de 1.5 ml) según la tabla...