Analisis inmuno

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MÉTODOS EN INMUNOLOGÍA
Gran parte de los progresos alcanzados por la biología moderna se deben al perfeccionamiento de los métodos analíticos de medida. La introducción de los procedimientos basados en las reacciones inmunológicas ha representado un importante avance en el análisis de sustancias de interés en biología animal y vegetal difíciles de medir empleando los métodos bioquímicoshabituales.
Dentro de los procedimientos inmunológicos, los más útiles y prácticos son aquellos que se basan en la especificidad de la unión Ag-Ac. La propiedad que tienen las Igs de unirse a un Ag, la especificidad de esta unión y el hecho de que pueda ser visualizable por los fenómenos de precipitación, aglutinación y otros mecanismos indirectos (marcaje con fluoresceína, con radioisótopos o conenzimas) hace que estos métodos se empleen ampliamente.
Existen diversos métodos basados en procedimientos distintos para visualizar la unión Ag-Ac (Tabla 1). Así tenemos:
• Técnicas de fluorescencia y citometría de flujo. Para la realización de estas técnicas el anticuerpo se marca con un fluorocromo, detectándose la formación del complejo Ag-Ac por la fluorescencia emitida.
• Técnicas deaglutinación. Cuando el antígeno se encuentra unido o formando parte de células, bacterias o partículas, la reacción Ag-Ac se puede detectar y cuantificar por el aglutinado celular o bacteriano formado.
• Técnicas de radioinmunoensayo. En estas técnicas al anticuerpo se le une un isótopo radiactivo, siendo posible la cuantificación del complejo Ag-Ac a través de la radiactividad emitida.
• Cromatografíade afinidad. La especificidad de la unión Ag-Ac puede utilizarse para obtener Acs y Ags puros.
• Inmunoprecipitación e inmunoblotting. Permite detectar la presencia y cantidad de antígenos y anticuerpos específicos.

Técnicas de precipitación
Para la realización de estas técnicas se requiere que tanto el Ac como el Ag se encuentren en un medio fluido en el que sea posible la precipitacióndel complejo Ag-Ac. Existen diferentes modalidades siendo las principales:
1. Técnica de precipitación propiamente dicha.
2. Técnica de difusión radial de Ouchterlony.
3. Técnica de inmunoelectroforesis.
4. Técnica de difusión radial simple de Mancini.
Técnica de precipitación
El complejo Ag-Ac precipita espontáneamente o por centrifugación cuando la proporción de Ags y Acs de la mezcla esequivalente. En la (Figura 1) se muestra un esquema de los tipos de complejos formados al mezclar, en tubos de ensayo, soluciones con diferentes cantidades de antígenos a los que se añaden igual cantidad de un antisuero. La precipitación es máxima allí donde la proporción entre ambos es óptima (parte central de la curva), pero va disminuyendo a medida que predomine el Ac o el Ag (izquierda yderecha de la curva respectivamente). Este tipo de reacción no es muy utilizado al requerirse grandes concentraciones de antígeno y de anticuerpo para poder medir el precipitado formado.
Técnica de difusión radial doble de Ouchterlony
Esta técnica se realiza en placas de agar en donde se practican pocillos (Figura 2). En uno de estos pozos se coloca el suero o muestras a investigar y en el resto secoloca el anticuerpo preparado frente a la sustancia que se quiere identificar.
Cuando difundan, ambos sistemas se encontrarán y se formará en la zona de equivalencia el complejo Ag-Ac correspondiente que se hace visible en forma de una línea de precipitación. En una preparación que contenga varios antígenos, se obtendrán múltiples líneas de precipitado. La técnica de Ouchterlony permiteidentificar sustancias según la forma de unirse las líneas de precipitación de dos o varios sistemas.
Técnica de Inmunoelectroforesis
La inmunoelectroforesis es una técnica que se realiza en dos fases. Primero se separa la mezcla de Ags por electroforesis y posteriormente el antígeno que se desea detectar se hace reaccionar con un anticuerpo específico colocado en un pocillo lateral. Por difusión...
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