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Introducción

Una enzima es una proteína que cataliza las reacciones bioquímicas del metabolismo. Las enzimas actúan sobre moléculas conocidas como sustratos y permiten el desarrollo de los diversos procesos celulares 1. Cada una de las enzimas tiene una temperatura y pH óptimo, cualquier cambio en estos factores puede afectar la actividad de la enzima, y a su vez para medir la actividadenzimática es necesario mantener estos dos factores constantes.
La fosfatasa ácida de germen de trigo cataliza la hidrólisis de los grupos fosfatos a partir de macromoléculas y moléculas más pequeñas que están almacenados en la semilla del trigo.
El sustrato a utilizar de la fosfatasa ácida, es el p-Nitrofenilfosfato, el cual es fácilmente reconocido por la enzima, ya que posee un resto orgánico conun grupo fosfato unido. Este sustrato al ser hidrolizado originando un producto, el p-Nitrofenol, compuesto que absorbe a una longitud de onda de 405 nm.
La reacción es detenida mediante la adición de NaOH, en donde se alcaliniza el medio y la enzima deja de funcionar.

Figura Nº 1: reacción enzimática

Para conocer el mecanismo de una reacción cataliza por medio de una enzima, es precisodeterminar la velocidad de la reacción y el modo el cual ésta cambia referente a las condiciones en las cuales esté presente, vale decir, la cantidad de sustrato presente con el cual interactúa o cualquier interferente que afecte su velocidad ( inhibidores).
Uno de los métodos para el estudio del mecanismo enzimático, es determinar los parámetros cinéticos a los cuales está sujeto el enzima.
Losparámetros cinéticos determinados en este informe son la Km y la Vmáx, que corresponden a la concentración de sustrato a la que la velocidad inicial es la mitad de la máxima (constante de Michaelis) y meseta donde se dan incrementos diminutos con el incremento de la concentración de sustrato, respectivamente2.
Para el estudio de estos parámetros es preciso graficar el comportamiento de éstos conla ecuación de Michalis-Menten, el cual da valores aproximados de dichos parámetros. Para poder obtener el valor exacto de estos parámetros es necesario linealizar mediante la transformación a la gráfica de dobles recíprocos.

Figura Nº 2: velocidad inicial v/s concentración sustrato (ecuación Michaelis-Menten)


Figura Nº 3: gráfica de dobles recíprocos

Las enzimas pueden presentarinhibiciones tanto reversibles como irreversibles, dependiendo del tipo de inhibidor al cual esté sujeto.
Entre las inhibiciones de tipo reversibles, encontramos las competitivas, un inhibidor competitivo es el que compite con el sustrato por el sitio activo de la enzima. Muchos inhibidores competitivos se parecen al sustrato, lo que les permite formar un complejo con la enzima.3
Otra inhibicióncorrespondiente al tipo reversible, es la acompetitiva, un inhibidor acompetitivo, corresponde al que se une a un sitio de la enzima distinto a la que se une el sustrato en el sitio activo, es decir se forma un complejo entre inhibidor-sustrato-enzima.
También existe la inhibición mixta, otro tipo reversible de inhibición, en la cual el inhibidor se une tanto al sitio activo de la enzima, como alcomplejo enzima-sustrato.
Las inhibiciones irreversibles corresponden a aquellas en donde el inhibidor se combina o destruye un grupo de enzimas que son esenciales para la actividad enzimática, o es aquel que forma una unión covalente muy estable.
Para determinar si un inhibidor enzimático es competitivo, acompetitivo o mixto, la gráfica de dobles recíprocos representa una forma fácil para poderhacerlo.

a) b)

c)

Figura Nº 4: dobles recíprocos en presencia de inhibidor a) inhibición competitiva. b) inhibición acompetitiva. c) inhibición mixta.

INTRODUCCIÓN

Las enzimas, los catalizadores de las reacciones en los sistemas biológicos, son proteínas complejas que producen un cambio químico específico en otras sustancias, sin que exista un cambio en ellas mismas...