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Reporte Laboratorio No. 8
Genética


• Técnicas de hibridación del ADN

Existen dos tipos de hibridaciones de ácidos nucléicos que se usan frecuentemente en los laboratorios que utilizan técnicas de biología molecular. Ambos métodos utilizan una cadena sencilla de ADN marcada por un método físico-químico, bien sea con radiactividad o bien con un fluorocromo. Esta cadena tiene una secuenciade nucleótidos conocida y se utiliza como sonda para detectar otras moléculas de ARN o ADN de cadena sencilla de secuencia parecida.

 Southern
El método tipo Southern o Southern blot fue desarrollado para la detección de genes específicos en el ADN celular. El ADN es digerido con una enzima de restricción y los fragmentos son separados por tamaños mediante electroforesis en un gel. Acontinuación los fragmentos de ADN de doble cadena son desnaturalizados mediante un proceso químico separando las dos hebras componentes del ADN en sus cadenas sencillas. Posteriormente, el ADN inserto en el gel es transferido a un filtro de nitrocelulosa, con lo que en el filtro queda representada una réplica de la disposición de los fragmentos de ADN presentes en el gel. A continuación el filtro seincuba durante un tiempo con la sonda marcada (radiactivamente o con un fluorocromo); durante la incubación la sonda se va hibridando con las moléculas de ADN de cadena sencilla de secuencia complementaria (o muy parecida). La sonda unida al fragmento de ADN complementario se puede visualizar en el filtro de una forma sencilla mediante una exposición a una película de rayos X para el caso de sondasradiactivas o con una película sensible a la luz, para el caso de sondas.

 Hibridación in situ
Un desarrollo de las técnicas de preparación y fijación de materiales biológicos para su observación al microscopio, junto con el desarrollo de técnicas de hibridación tipo Northern ha llevado a poder realizar la hibridación de las sondas directamente sobre tejidos de material orgánico. Utilizandotécnicas inmunohistoquímicas se puede conocer la localización precisa de los tejidos y células que están expresando los genes de secuencia complementaria a las sondas utilizadas. También en esta categoría destaca el FISH, técnica de hibridación in situ, donde las sondas son secuencias de ADN marcadas que se unen a secuencias de ADN conocidas dentro del cromosoma, con las que comparte un alto grado desimilitud y que podemos observar con un microscopio óptico de fluorescencia.







• PCR (reacción en cadena de la polimerasa)

La técnica se basa en la replicación del ADN en los organismos eucariotas realizada por la DNA polimerasa. Estas enzimas realizan la síntesis de una cadena complementaria de DNA en el sentido 5´-> 3´ usando un molde de cadena sencilla, pero a partir de unaregión de doble cadena. Para crear esta región doble cadena se usan los denominados iniciadores (primers). Son una pareja de oligonucleótidos sintetizados de manera que sean complementarios a cada uno de los extremos 3´ del fragmento de DNA que se desea amplificar. Partiendo de este principio, la reacción en Cadena de la Polimerasa se basa en la repetición de un ciclo formado por tres etapas:

1ªDesnaturalización del ADN doble cadena: la doble hélice de ADN se separa en dos hebras. Para ello se realiza una incubación de la muestra a altas temperaturas (93-97ºC). La renaturalización se producirá cuando la temperatura disminuya.

2ª Hibridación de los iniciadores a la zona 3´ específica de cada una de las hebras: los cebadores se unen a las zonas 3´ complementarias que flanquean el fragmentoque queremos amplificar. Se realiza gracias a la bajada de la temperatura (50-65º C)

3ª Extensión del cebador por actuación de la DNA polimerasa: se produce la síntesis de una cadena sencilla (produciéndose un fragmento de doble cadena por la complementariedad) en la dirección 5´-> 3´ mediante la enzima DNA polimerasa, la cual incorpora los desoxinucleótidos fosfato presentes en el medio...
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