Cinetica enzimática

PURIFICACIÓN Y CARACTERIZ ACIÓN CINÉTICA DE POLIFENOL OXIDASA DE TOMATE

Juan Casado Vela

1.-INTRODUCCIÓN: Las polifenol oxidasas (PPOs) (EC 1.14.18.1 o EC 1.10.3.2) son enzimas ubicuas en plantas que catalizan la reacción dependiente de oxígeno que transforma o-difenoles en o-quinonas. Estas quinonas son especies muy reactivas capaces de modificar covalentemente un amplio abanico deespecies nucleófilas del interior de las células que conduce a la formación de polímeros marrones o negros responsables de importantes pérdidas económicas en el mercado de frutos y vegetales (Mayer y Harel, 1979; Lee y Whitaker, 1995). Esta es la razón fundamental por la que el contenido en fenoles y la actividad polifenol oxidasa se consideran determinantes en la calidad de frutos y vegetales (Wrolstady col., 1988; Lee y Whitaker, 1995). La presencia de PPO se ha podido determinar y caracterizar utilizando hojas y frutos de numerosas especies vegetales como fuente enzimática (Mayer y Harel, 1979; Mayer, 1987). Los niveles de PPO varían dependiendo de la especie, cultivar, estadio de maduración y estadio fenológico. (Amiot y col., 1995). En tejidos vegetales intactos las PPOs y sus sustratosfenólicos permanecen en compartimentos separados, cloroplastos y vacuolas respectivamente, por lo que no tiene lugar ninguna reacción. La desorganización de la integridad de las células sucede de forma natural durante procesos de senescencia, pero también como consecuencia de daños mecánicos, que provocan una ruptura celular y una puesta en contacto de PPO y fenoles dando lugar a reacciones depardeamiento enzimático observadas en frutos maduros, tejidos dañados y/o procesados y también en tejidos afectados por fisiopatías. Los frutos de tomate no son proclives a la aparición de fenómenos de pardeamiento como consecuencia de procesos de senescencia o daños mecánicos, sin embargo, si se han descrito pardeamiento de tejidos afectados por infecciones víricas, bacterianas y fúngicas, así comoconsecuencia de la aparición de podredumbre apical. La purificación y caracterización de PPO es un paso fundamental en la investigación de esta enzima en los procesos descritos, particularmente en la podredumbre apical. Aunque la enzima ha podido ser aislada y caracterizada en numerosas fuentes vegetales, no existen trabajos similares que utilicen tomate como fuente de partida. En este sentido,Czapski y Saniewski (1988) determinaron la presencia de actividad PPO en extractos frutos de tomate y estudiaron la influencia de la hormona metil jasmonato en los niveles de esta enzima. Por otra parte, Hobson (1967) midió actividad fenolasa en preparaciones cetónicas de frutos de tomate y estudió su evolución durante el crecimiento y maduración, así como la variación de los niveles de actividad enfrutos afectados por podredumbre apical. En contraste con la falta de información de la enzima PPO en frutos de tomate, existe un profundo conocimiento de la expresión espacial y temporal de los genes que codifican para esta enzima. Thipyapong y col., (1997) demostró que cada una de las isoformas de PPO presentes en tomate presentan patrones de regulación diferentes en tejidos vegetativos yreproductivos durante el crecimiento y diferenciación celular en plantas de tomate. Técnicas de inmunolocalización e hibridación in situ han mostrado la presencia de proteína PPO madura y RNAm en varios tejidos de frutos jóvenes (hasta 7 días post-antesis), en concreto en células
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Juan Casado Vela

solitarias delparénquima denominadas idioblastos, que son capaces de acumular niveles elevados de PPO (Thipyapong y Steffens, 1997). El estudio del patrón de expresión temporal de PPO mostró una acumulación de isoenzimas B y E/F en óvulos de frutos jóvenes en desarrollo. El desconocimiento de la función de las PPOs se puede atribuir a la ausencia de un protocolo de extracción apropiado para este tejido, al...