CROMATOGRAF A ASCENDENTE DE AMINO CIDOS

¿DE QUÉ FORMA TRABAJAN JUNTAS LA CROMATOGRAFÍA Y LA NINHIDRINA?
Amat Maruri Daniela Alejandra, Bertado Castell Laura, Herrera Islas Katia, Lima Díaz Paloma Amalinalli, Zecua Bello Pablo.
INTRODUCCIÓN.
Para la caracterización de las diferentes biomoléculas existentes, es necesario aplicar métodos de aislamiento y purificación, para realizar se utiliza un método muy efectivo, que es lacromatografía. El término de cromatografía fue definido por el botánico ruso Miguel Tswett en 1906 y eligió el término cromatografía, de las palabras griegas khromatos (color) y graphos (escrito) ya que utilizó el término para describir la separación de pigmentos vegetales en distintas zonas coloreadas.
La cromatografía se basa prácticamente en la separación de los componentes de la muestra, distribuyéndoseen dos fases, esto debido a la variación de la velocidad que se establece a los componentes al ser arrastrados por una fase móvil (líquida o gaseosa) y a través de una fase estacionaria (sólida o líquida). La fase móvil arrastra con ella a los compuestos de la mezcla y en la fase estacionaria están retenidos los componentes de la muestra.
Existen diferentes tipos de cromatografía para responder demanera efectiva, correspondiendo a cada caso que depende del fundamento físico-químico a separar (tabla 1).




La cromatografía en papel, es una técnica en la que se aplica un pequeño volumen de la muestra en uno de los extremos de una hoja de papel filtro. Esta puede ser ascendente, en la que el papel se sujeta a la parte superior de la cámara y se sumerge en el solvente, que se encuentra enel fondo, el solvente se mueve hacia arriba por capilaridad. Al realizarse la separación, los solutos de la mezcla original migran a lo largo del papel con diferentes velocidades, dependiendo de la solubilidad en el solvente. La relación de migración de una sustancia (Rf) puede expresarse de acuerdo con la siguiente fórmula.


La ninhidrina reacciona con aminoácidos que tengan el grupo aminolibre (imagen 1), dando lugar a la formación de amoniaco y anhídrido carbónico, con reducción del reactivo (ninhidrina) a hidrindantina. La hidrindantina reacciona a su vez con el amoniaco y otra molécula de ninhidrina para dar un compuesto de adición doble que presenta una coloración azul-púrpura, con la excepción de la prolina que da una coloración amarillenta (recordar que en la prolina el grupoamino está sustituido).

Imagen 1. Reacción general de aminoácidos con ninhidrina

OBJETIVOS.
Realizar una cromatografía ascendente de aminoácidos
- Separar una mezcla de aminoácidos
- Observar la coloración de los aminoácidos por su reacción con la ninhidrina.
- Obtener el corrimiento cromatográfico de aminoácidos (polar y no polar) y comparar el Rf de cada uno de ellos.
-Calcular el Rf de cada uno de los aminoácidos
MATERIAL.
-Cámara cromatográfíca
-Papel para cromatografía (16 cm de largo por 18 cm de ancho)
-Estufa a 90°C
-Capilares
-Lápiz
-Regla
Reactivos:
-Aminoácidos en solución 0.05 M
-Hidrolizado de caseína
-Solvente: n-Butanol: Ácido acético glacial: Agua (4:1:5)
-Revelador: Solución de Ninhidrina
-Hidróxido de amonio concentrado

METODOLOGÍA.Observaciones:
-Aminoácidos utilizados:

Serina Prolina Lisina

*Estaban presentes en una solución transparente.
-El papel se pasó por el hidróxido de amonio aproximadamente 25 veces para neutralizar las cargas.
-El olor del solvente fue un poco fuerte para el olfato, sin embargo, el olor de la ninhidrina fue muy penetrante, tanto que se tuvo que utilizarestrictamente cubre bocas, gafas de seguridad, la bata estar completamente cerrada y los guantes integros.

-Se colocó el papel dentro de la estufa a 90°C aproximadamente por 2 minutos.
-Los aminoácidos al colocarse sobre el papel, eran incoloros, al revelarlos tomaron el color que le correspondía (prolina-amarillo, leucina-púrpura, serina-púrpura).
CUESTIONARIO.
1.- Defina los siguientes términos:
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