Cromatografía líquida de alta eficacia (hplc) (muestra de coca-cola desgasificada)
Páginas: 5 (1177 palabras)
Publicado: 30 de noviembre de 2010
INTRODUCCION
La Cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) es un tipo de cromatografía en columna utilizada frecuentemente en bioquímica y química analítica. También se la denomina a veces Cromatografía líquida de alta presión (HPLC), aunque esta terminología se considera antigua y está en desuso. El HPLC es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose endiferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatográfica. En la HPLC isocrática el compuesto pasa por la columna cromatográfica a través de la fase estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeñas partículas redondeadas con ciertas características químicas en su superficie) mediante el bombeo de líquido (fase móvil) a alta presión a través de lacolumna. La muestra a analizar es introducida en pequeñas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones químicas o físicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna. El grado de retención de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la composición de la fase estacionaria y de la fase móvil. El tiempo quetarda un compuesto a ser eluido de la columna se denomina tiempo de retención y se considera una propiedad identificativa característica de un compuesto en una determinada fase móvil y estacionaria. La utilización de presión en este tipo de cromatografías incrementa la velocidad lineal de los compuestos dentro la columna y reduce así su difusión dentro de la columna mejorando la resolución de lacromatografía. Los disolventes más utilizados son el agua, el metanol y el acetonitrilo. El agua puede contener tampones, sales, o compuestos como el ácido trifluoroacético, que ayudan a la separación de los compuestos (1).
Una mejora introducida a la técnica de HPLC descrita es la variación en la composición de la fase móvil durante el análisis, conocida como elución en gradiente. Un gradientenormal en una cromatografía de fase reversa puede empezar a un 5% de acetonitrilo y progresar de forma lineal hasta un 50% en 25 minutos. El gradiente utilizado varía en función de la hidrofobicidad del compuesto. El gradiente separa los componentes de la muestra como una función de la afinidad del compuesto por la fase móvil utilizada respecto a la afinidad por la fase estacionaria. En el ejemplo,utilizando un gradiente agua/acetonitrilo los compuestos más hidrofílicos eluirán a mayor concentración de agua, mientras que los compuestos más hidrofóbicos eluirán a concentraciones elevadas de acetonitrilo. A menudo, hace falta realizar una serie de pruebas previas con tal de optimizar el gradiente de forma que permita una buena separación de los compuestos(2).
OBJETIVOS
• Conocer ymanejar un equipo HPLC
• Determinar el contenido de cafeína en una muestra problema
MATERIALES Y METODOS
A partir de la solución stock de cafeína de 1000mg/L, se preparó, en matrazes volumétricos de 25 mL, un conjunto de 5 soluciones con concentraciones de 50 a 500 mg/L, las que se enrasaron con agua HPLC, para realizar la curva de calibración. Cada volumen se tomo con pipetasvolumétricas y micropipetas.
Se extrajo una muestra de coca-cola, desgasificada, en un tubo ependorf como muestra problema, para medir su contenido en cafeína.
Se inyecta cada muestra, una a una, por medio de una jeringa Hamilton, evitando la formación de burbujas, en el equipo HPLC.
|fase móvil |CH3CN/Agua 20:80|
|detector |UV a 270 nm |
|columna |RP-18 125x4 |
|flujo |1,0 ml/min...
La Cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) es un tipo de cromatografía en columna utilizada frecuentemente en bioquímica y química analítica. También se la denomina a veces Cromatografía líquida de alta presión (HPLC), aunque esta terminología se considera antigua y está en desuso. El HPLC es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose endiferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatográfica. En la HPLC isocrática el compuesto pasa por la columna cromatográfica a través de la fase estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeñas partículas redondeadas con ciertas características químicas en su superficie) mediante el bombeo de líquido (fase móvil) a alta presión a través de lacolumna. La muestra a analizar es introducida en pequeñas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones químicas o físicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna. El grado de retención de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la composición de la fase estacionaria y de la fase móvil. El tiempo quetarda un compuesto a ser eluido de la columna se denomina tiempo de retención y se considera una propiedad identificativa característica de un compuesto en una determinada fase móvil y estacionaria. La utilización de presión en este tipo de cromatografías incrementa la velocidad lineal de los compuestos dentro la columna y reduce así su difusión dentro de la columna mejorando la resolución de lacromatografía. Los disolventes más utilizados son el agua, el metanol y el acetonitrilo. El agua puede contener tampones, sales, o compuestos como el ácido trifluoroacético, que ayudan a la separación de los compuestos (1).
Una mejora introducida a la técnica de HPLC descrita es la variación en la composición de la fase móvil durante el análisis, conocida como elución en gradiente. Un gradientenormal en una cromatografía de fase reversa puede empezar a un 5% de acetonitrilo y progresar de forma lineal hasta un 50% en 25 minutos. El gradiente utilizado varía en función de la hidrofobicidad del compuesto. El gradiente separa los componentes de la muestra como una función de la afinidad del compuesto por la fase móvil utilizada respecto a la afinidad por la fase estacionaria. En el ejemplo,utilizando un gradiente agua/acetonitrilo los compuestos más hidrofílicos eluirán a mayor concentración de agua, mientras que los compuestos más hidrofóbicos eluirán a concentraciones elevadas de acetonitrilo. A menudo, hace falta realizar una serie de pruebas previas con tal de optimizar el gradiente de forma que permita una buena separación de los compuestos(2).
OBJETIVOS
• Conocer ymanejar un equipo HPLC
• Determinar el contenido de cafeína en una muestra problema
MATERIALES Y METODOS
A partir de la solución stock de cafeína de 1000mg/L, se preparó, en matrazes volumétricos de 25 mL, un conjunto de 5 soluciones con concentraciones de 50 a 500 mg/L, las que se enrasaron con agua HPLC, para realizar la curva de calibración. Cada volumen se tomo con pipetasvolumétricas y micropipetas.
Se extrajo una muestra de coca-cola, desgasificada, en un tubo ependorf como muestra problema, para medir su contenido en cafeína.
Se inyecta cada muestra, una a una, por medio de una jeringa Hamilton, evitando la formación de burbujas, en el equipo HPLC.
|fase móvil |CH3CN/Agua 20:80|
|detector |UV a 270 nm |
|columna |RP-18 125x4 |
|flujo |1,0 ml/min...
Leer documento completo
Regístrate para leer el documento completo.