Cuantificación de anticuerpos IgG por ELISA indirecta.

Introducción:
ELISA son las siglas por las que se conoce al ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (en inglés enzyme-linked immunosorbent assay). El ELISA se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática. Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con unaenzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reacción antígeno-anticuerpo quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada mediante la adición de un substrato especifico que al actuar la enzima producirá un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro.
Los diferentes tipos de ELISA son los siguientes:Anticuerpos marcados: ELISA Directo, ELISA Indirecto, ELISA sándwich (Doble; DAS y Heterólogo; HADAS).
Antígeno marcado: ELISA competitivo.
El método directo permite la detección del antígeno con un anticuerpo específico conjugado con una enzima como sistema de marcaje. En el método indirecto el antígeno reacciona con el anticuerpo específico. El complejo antígeno-anticuerpo es entonces detectado por unsegundo anticuerpo que reconoce dominios constantes de anticuerpos. Este anticuerpo, que suele ser específico de especie, es el que está marcado enzimáticamente. Esto permite que un mismo anticuerpo marcado sea capaz de detectar diferentes antígenos. El ELISA sándwich cuantifica antígenos entre dos capas de anticuerpos (es decir, anticuerpos de captura y detección). El antígeno que va a medirdebe contener al menos dos epítopos antigénicos capaces de unirse al anticuerpo, ya que al menos dos anticuerpos actúan en el sándwich. La ventaja de Sándwich ELISA es que la muestra no tiene que ser purificado antes de su análisis, y el ensayo puede ser muy sensible. ELISA competitivo: el anticuerpo de la muestra va a competir con el conjugado por un número limitado de sitios de unión del antígeno.Habrá ausencia de color en una muestra positiva debido a que el sustrato no encontrará a la enzima porque el conjugado ha sido desplazado por el anticuerpo presente en la muestra.
En cuanto a los patógenos a detectar (indirectamente) son el virus de la influenza y el rotavirus. El virus de la Influenza (A, B o C) se caracteriza por poseer una gran variabilidad genética y el potencial de causarepidemias y pandemias, provoca la influenza, una enfermedad respiratoria aguda que afecta a todos los grupos etarios. El cuadro clínico de la influenza clásica, es el de una enfermedad respiratoria alta, comienzo abrupto, fiebre, escalofríos, malestar, cefaleas, mialgias y tos no productiva. El rotavirus produce una infección intestinal o gastroenteritis, que es la causa más común de diarreasevera en niños, especialmente entre los 6 meses y 5 años de vida. En los casos más graves, la deshidratación generada puede llegar a ser mortal. Los adultos también pueden infectarse, aunque la enfermedad tiende a ser leve, este virus es muy contagioso. Los síntomas son vómitos explosivos, diarrea acuosa a repetición, fiebre y dolor abdominal.

Metodología:
1. Sensibilizar 16 pozos (placa de 96)con 75µL (por pozo) de proteína purificada recombinante a una concentración de 20µg/mL diluida en buffer carbonato-bicarbonato.
2. Incubar la placa a 4C por 12 horas (toda la noche).
3. Retirar el antígeno (M1 o VP4) y lavar una vez con 200µL PBS-T.
4. Adicionar 200µL de solución de bloqueo (leche descremada 5% - PBS-T).
5. Incubar la placa a 37C por 12 horas.
6. Retirar solución de bloqueo ylavar con 250µL PBS-T cuatro veces.
7. Adicionar 75µL por pozo de cada dilución del suero problema.
8. Incubar a temperatura ambiente por 30 minutos.
9. Retirar el suero y lavar con PBS-T cuatro veces.
10. Adicionar 75µL por pozo de conjugado diluido 1:2,500 (Anti-IgG humano-HRP).
11. Incubar a temperatura ambiente por 20 minutos.
12. Retirar el conjugado y lavar 4 veces con TBS-T.
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