Cultivo De Levadura Por Sistema De Lote

Materiales y Métodos
Medio YEPD
YEPD o Extracto de levadura peptona dextrosa, también a menudo abreviado como YPD, es un medio completo para crecimiento de levadura.
Reactivos para un litro de medio de cultivo
Extracto de levadura 10 g, Peptona 20 g, Dextrosa 20 g, Agua destilada, Agar 18 g
Materiales
Cajas petri estériles, Medidor de pH, Pipetas estériles de 1ml y 10 ml, Asa metálica,Mechero bunsen, Estufa para incubación 25 °C, Estufa para secado a 60°C, Erlenmeyer o frascos de 125 y 500 ml, Plancha de agitación, Agitador magnético, Centrifuga, Tubos para centrifugar de 15 ml, Cultivo de levadura, Mortero, Arena lavada, Tubos de ensayo, Solución de sacarosa 0.2 M.
Reactivos
Reactivos para preparar la solución de DNS
DNS, NaOH 1M, Tartrato de sodio y potasio
Reactivos parael tampón de extracción
Acetato de sodio 100 ml 0.1 M, Acido acético 50 ml 0.1 M, Cloruro de sodio

Metodología
Preparación del medio
Disolver los componentes del medio en agua hirviente. Regular el pH final del medio a 5,4. Esterilizar en un autoclave por 20 minutos a 15 libras de presión.
Obtención de inoculo
Con un asa de transferencia tomar una porción de células de levadura, einocular la porción en 30 ml del medio de cultivo estéril. Agitar fuertemente el medio inoculado con la ayuda de una plancha de agitación magnética e incubar a temperatura ambiente toda la noche. A la manan siguiente el cultivo deberá rendir 1x107 células /ml.
Al día siguiente, asépticamente tomar alícuotas de cultivo líquido con una pipeta estéril y realizar una serie de diluciones, las necesariaspara obtener un contaje adecuado.
Asépticamente pipetear 1ml de cada dilución, depositarlo en las cajas petri mezclar con el medio que contiene el agar y mezclar cuidadosamente para que la muestra que contiene las diluciones se esparza homogéneamente en la placa. Incubar el cultivo a 25 °C por 5 días.
Contaje
Cuente las colonias de levadura de las cajas después de los 5 días de incubación. Si nohubiera crecimiento en este periodo, reincubar por 48 horas adicionales. No cuente las colonias antes de completar el periodo de incubación por que la manipulación de las cajas podría producir un crecimiento secundario de algunas colonias e invalidar el contaje. Contar las cajas que contengan de 10 - 150 colonias son contables. Sin embargo si esta presente sustanciales cantidades de hongos,dependiendo del tipo de hongo, el limite superior debe ser disminuido a discreción del analista. Reporte los resultados de UFC/ml.
Obtención de la curva de crecimiento en cultivo por lote
Verter asépticamente el inoculo en el reactor que contiene aproximadamente 320 ml de medio liquido y accionar el cronometro y el agitador magnético.
Extraer asépticamente dos alícuotas de i ml de cada una delcultivo a 0.1, 2, 3, 4, 6, 9, 20, 24 y 30 horas de incubación.
Colocar las alícuotas en los tubos de centrifuga, pesar rápidamente el tuvo con la muestra y hervir por 5 min. Enfriar y centrifugar. Extraer el sobrenadante, lavar las células resuspendiendolas en agua destilada, volver a centrifugar y retirar el sobrenadante. A continuación secar pesar los tubos y secarlos a 60 C hasta peso constante.Determinación del Coeficiente de Rendimiento Yx/s para el Cultivo de S. Cerviciae
Determinación del consumo de sustrato.
Diluir los sobrenadantes de las muestras tomadas a los tiempos especificados y determinar el contenido de azúcares reductores con solución de DNS.
Cuantificación de azúcares reductores
Preparación de la solución de DNS (100 ml): disolver 1 g de DNS (sólido) en 40 ml deagua destilada con ayuda de un agitador magnético.- Añadir 20 ml de solución de NaOH 1M. A continuación agregar lentamente 30 g de tartrato de sodio y potasio. Agitar hasta que se disuelva. Si es necesario (cuando se forma un precipitado) agregar más agua destilada y calentar ligeramente. Finalmente aforar la solución a 100 ml.
Determinación del contenido de azúcares reductores: colocar 0.5 ml de...