Curva estándar de proteína

INTRODUCCIÓN:

Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica de rutina básica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta, cuando se quiere conocer la actividad específica de una preparación enzimática, para el diagnóstico de enfermedades, así como para otros muchos propósitos.(1)
La elección del método que debe utilizarsepara la cuantificación de las proteínas de una muestra, depende básicamente de seis puntos principales:
1. La cantidad de proteína disponible para el ensayo.
2. Su concentración.
3. La especificidad de la técnica.
4. La presencia de sustancias químicas que pueden interferir en el ensayo.
5. La disponibilidad de los reactivos para su realización.
6. Su sensibilidad.Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se basan en:
a) La propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV, o bien llamados métodos directos.
Los métodos espectroscópicos son de gran utilidad para el análisis de la estructura y la función de las proteínas. Las cadenas laterales de la tirosina, la fenilalanina y el triptófano, aligual que los enlaces peptídicos de las proteínas, absorben la luz ultravioleta (UV). La diferencia en la absorción de la energía luminosa por cada cromóforo está relacionada con su coeficiente de extinción molar (ε). (2)
[pic]
Espectro UV-Visible -El máximo de absorción para BSA (280nm) (5, 6)

Las proteínas absorben luz en la región UV con dos máximos: a 280 nm (menor energía) y200 nm (mayor energía), según el tipo de electrones que puedan ser excitados. Los electrones que absorben menos energía (280 nm), son los ubicados en los anillos aromáticos de la fenilalanina, triptófano, histidina y tirosina. Es de esperarse que la proteína con un bajo contenido de aminoácidos aromáticos presente una menor absorbancia. Tanto la estructura secundaria como la terciaria, puedeninfluir en el espectro de absorbancia de la proteína. Es por esto que factores como el pH del buffer, polaridad y fuerza iónica pueden alterar la absorción de la luz. (3)
Las uniones peptídicas absorben fotones a 210 nm debido al alto número de uniones presentes en una proteína. Este es un rango particularmente sensible, pero presenta la desventaja que algunos de los químicos quecontienen dobles enlaces entre carbonos o entre carbono y oxígeno, pueden presentar interferencias. (3)
b) Métodos indirectos, bien conocidos como ensayos colorimétricos:
Aunque estos son tal vez los más utilizados, tienen la desventaja de tener que utilizar la misma proteína como patrón para obtener valores reales; éstos se deben ensayar en las mismas soluciones y al mismo tiempo que lasmuestras desconocidas para descartar variables tales como las interacciones de los reactivos con el buffer, la descomposición de los reactivos, las diferencias de tiempo y los cambios de temperatura. (3)
Dentro de los métodos colorimétricos de alta sensibilidad, los más utilizados son el de Bradford y el de Lowry. El Método de Lowry: En condiciones alcalinas, el Cu2+ forma un complejo conlas uniones peptídicas de las proteínas, y se reduce el Cu+. El Cu+ y los grupos radicales de los residuos de tirosina, triptófano y cisteína reaccionan con el reactivo de Folin. El reactivo forma inicialmente un producto inestable, el cual es lentamente reducido hasta formar azul de molibdeno/tungsteno. Los agentes acidificantes y los quelantes o reductores del cobre pueden interferir con elensayo. (3)


[pic] [pic]

En este contexto, si un método colorimétrico es utilizado para la cuantificación de proteínas en una muestra, se infiere que puede ser un ejemplo de aplicación de la espectrofotometría en estudios bioquímicos. Nuestro objetivo es medir la concentración de una proteína, aplicando el fundamento de la...