Determinación de la concentración de una proteína

Universidad de Chile Facultad de Ciencias Departamento de Bioquímica.

Laboratorio 1:

“Determinación de la Concentración de una Proteína”
Integrantes: Violeta Kallens Meza Raúl Segovia Pavéz Carrera: Ing. en Biotecnología M. Profesoras: Victoria Guixé Ana Preller Curso: Bioquímica Fecha de realización: 11/08/2010 Fecha de Entrega: 19/08/2010

Resumen:
En este práctico se realizó lamedición de la concentración de una muestra problema utilizando el método de Bradford con BSA (seroalbúmina de bovino), el cual contiene un compuesto que se une a ciertos residuos aminoacídicos coloreando de esta manera el compuesto a medir. Este requiere la utilización de la fotometría debido a la relación directa que existe entre la concentración y la absorbancia. Se realizó de esta forma una curvade calibración con concentraciones de BSA ya conocidas y posteriormente se interpoló esta recta antes realizada para obtener la concentración de proteínas de la muestra problema. La función que relaciona absorbancia y concentración de nuestra curva de calibración, obtenida mediante las mediciones al espectrofotómetro, arrojó un R2 muy cercano a 1 por lo que es posible asumir su linealidad, esdecir que cumple la Ley de Lambert Beer, por esto fue posible realizar la interpolación y obtener la concentración buscada, esta fue de 10,83 mM por lo que nuestros resultados mostraron un 8,3% de error, lo que nos lleva a creer que el método resultó muy eficiente en la determinación de la concentración buscada.

Introducción
Durante el presente trabajo experimental, lo que se pretende esdeterminar la concentración de una muestra problema de proteína BSA (seroalbúmina de bovino), para lo que utilizaremos el método de Bradford, en el que para comenzar crearemos una curva de calibración con concentraciones previamente conocidas de dicha proteína. Este método en particular, tiene una gran sensibilidad, que lo hace útil en un rango de cuantificación entre 1 a 10 [µL] de proteína [2], lo que loha convertido en uno de lo métodos que más se utilizan hoy en día en los laboratorios. Sin embargo, también cuenta con una desventaja, y es que la variación de acoplamiento entre las distintas proteínas es bastante significativa, lo que se debe principalmente a la diferencias existentes entre ellas en cuanto a su estructura y dimensiones, por lo tanto, incluso si se mantienen las mismascondiciones de la medición (solvente, temperatura y longitud de onda), no es posible utilizar la misma curva de calibración para diferentes proteínas, aunque éstas sean parecidas entre sí. Este método no es el único existente, también hay otros, como lo son el método de Biuret y Lowry entre otros, los que, junto con Bradforf, aplican a la ley de Lambert-Beer, que vincula el trecho recorrido por la luz alpasar a través de la solución con la baja en la intensidad de la luz transmitida. Es necesario dejar bien en claro que es preciso conocer el rango de concentraciones para el cual es posible aplicar la ley de Lambert-Beer, para que cuando llegue el momento, poder elegir de manera efectiva la técnica que involucre un procedimiento espctofotométrico.

Materiales:
Solución patrón de BSA 0,1[mg/mL]. Reactivo de Bradford. Muestra problema B.

Construcción del protocolo y procedimientos:
Se diluyó la solución patrón de BSA 8 veces, es decir: 1 [mL] de BSA patrón + 7 [mL] de Agua destilada. 100 [µg/mL] = 12,5 [µg/mL] 8 Luego por regla de tres obtenemos los volúmenes que debemos utilizar para tener la cantidad de BSA dentro del rango medible por el método Bradford. 12,5 [µg] 9 [µg] 7,5 [µg]5 [µg] 2,5 [µg] 1 [mL] x = 0,72 [mL] x = 0,6 [mL] x = 0,4 [mL] x = 0,2 [mL]

Se rellenaron con agua destilada hasta completar 0,8 [mL] según como correspondiera en cada caso y luego se le agregó 0,2 [mL] de Bradford a todos los tubos. Posteriormente se les midió la absorbancia utilizando un espectrofotómetro a la longitud de onda de 595 [nm]. Se realizó una muestra blanco para posteriormente...