Determinacion De Proteinas
Páginas: 8 (1934 palabras)
Publicado: 4 de mayo de 2012
INTRODUCCION
Las proteínas ocupan un lugar de máxima importancia entre las moléculas
constituyentes de los seres vivos (biomoléculas). Prácticamente todos los procesos
biológicos dependen de la presencia y/o actividad de este tipo de sustancias. Son proteínas casi todas las enzimas, catalizadores de reacciones químicas en
organismos vivientes; muchas hormonas, reguladores de actividadescelulares, etc.
Para determinar la cuantificacion de una proteina esxiste una variedad de metodos basados en reacciones quimcas, perp en el siguiente practico veremos el metoso de biuret y bradford.
Reaccion de biuret: Consiste en tratar una proteína o péptido con Cu++ en medio alcalino, produciéndose una coloración violácea por formación de un complejo de coordinación entre el Cu++ y los pareselectrónicos libres de los nitrógenos de los grupos imino de la unión peptídica. Son necesarias por lo menos dos uniones peptídicas para que tenga lugar la reacción.
La reacción del biuret no es una reacción específica para proteínas. Eso hace que un resultado positivo con este reactivo deba ser cuidadosamente evaluado para descartar los resultados falsos positivos.
Un resultado negativo dela reacción del biuret sobre una muestra problema no necesariamente indica la ausencia de proteínas, ya que puede ocurrir:
a) que no existan proteínas o péptidos en la muestra (ni tampoco otras sustancias no proteicas biuret positivas)
b) que existan una o más sustancias interferentes en la muestra que impidan que se produzca la reacción (lo que daría lugar a un resultado falso negativo. Estopuede descartarse (o evitarse) si conozco de antemano la composición aproximada de la muestra.
c) Que existan péptidos, pero a una concentración inferior al límite de sensibilidad del método. Todo método permite determinar la presencia de un compuesto sólo si la concentración del mismo es superior a cierto valor.
Reaccion de bradford: El método involucra la unión de un colorante, elCoomassie Brilliant Blue G-250 (CBB) a las proteínas. La solución del colorante libre es de color rojizo (máxima absorción a 465 nm) y cambia al azul (máxima absorción a 595 nm). La unión es un proceso rápido (aproximadamente 2 minutos) y el complejo colorante-proteína se mantiene estable hasta una hora después de producido.
Como en esta reacción el CBB se une específicamente a las proteínas, es unbuen método de caracterización (aunque no de identificación). La reacción se prefiere a otras por su sensibilidad (mayor que la del biuret), lo que significa que, para una misma muestra, puede obtenerse un resultado positivo con el reactivo de Bradford pero negativo con el reactivo del biuret.
Dado que aún los materiales biológicos más sencillos poseen una composición química compleja, siempre sedebe de tener en cuenta la posibilidad de interferencias (positivas o negativas).
Objetivos
Conocer métodos de cuantificación de proteínas mediante reacciones químicas, como las reacciones de Biuret y Bradford.
Conocer la concentración de una muestra problema de proteínas mediante espectrofotometría, realizando una curva de calibración.
Procedimiento y materiales
Se utlizaron 6 tubosde ensayo a los cuales se les agregaron 200, 400, 600, 800 y 1000 µl de albúmina solución estándar u. El tubo 6 se utilizó como blanco, utlizando agua destilada, agregando 1 ml de ésta. Cada tubo se enrasó a 1 ml con agua destilada, esto se hizo agregando al primer tubo 800 µl, al segundo 600µl, al tercero 400 µl, al cuarto 200 µl y al quinto tubo no se le agregó agua destilada. A cada tubo se leagregaron 4 ml de reactivo de Biuret previamente preparado con una pipeta volumétrica de 5 ml. En otro tubo de ensayo se agregaron alrededor de 1 ml de muestra problema. Se agregaron 4 ml de reactivo de Biuret a los tubos y se dejó reposar por 30 minutos.
Mientras se dejaba desarrollar color en los tubos de la reacción de Biuret, Se procedió realizar el método de Bradford. En 6 tubos de ensayo...
Las proteínas ocupan un lugar de máxima importancia entre las moléculas
constituyentes de los seres vivos (biomoléculas). Prácticamente todos los procesos
biológicos dependen de la presencia y/o actividad de este tipo de sustancias. Son proteínas casi todas las enzimas, catalizadores de reacciones químicas en
organismos vivientes; muchas hormonas, reguladores de actividadescelulares, etc.
Para determinar la cuantificacion de una proteina esxiste una variedad de metodos basados en reacciones quimcas, perp en el siguiente practico veremos el metoso de biuret y bradford.
Reaccion de biuret: Consiste en tratar una proteína o péptido con Cu++ en medio alcalino, produciéndose una coloración violácea por formación de un complejo de coordinación entre el Cu++ y los pareselectrónicos libres de los nitrógenos de los grupos imino de la unión peptídica. Son necesarias por lo menos dos uniones peptídicas para que tenga lugar la reacción.
La reacción del biuret no es una reacción específica para proteínas. Eso hace que un resultado positivo con este reactivo deba ser cuidadosamente evaluado para descartar los resultados falsos positivos.
Un resultado negativo dela reacción del biuret sobre una muestra problema no necesariamente indica la ausencia de proteínas, ya que puede ocurrir:
a) que no existan proteínas o péptidos en la muestra (ni tampoco otras sustancias no proteicas biuret positivas)
b) que existan una o más sustancias interferentes en la muestra que impidan que se produzca la reacción (lo que daría lugar a un resultado falso negativo. Estopuede descartarse (o evitarse) si conozco de antemano la composición aproximada de la muestra.
c) Que existan péptidos, pero a una concentración inferior al límite de sensibilidad del método. Todo método permite determinar la presencia de un compuesto sólo si la concentración del mismo es superior a cierto valor.
Reaccion de bradford: El método involucra la unión de un colorante, elCoomassie Brilliant Blue G-250 (CBB) a las proteínas. La solución del colorante libre es de color rojizo (máxima absorción a 465 nm) y cambia al azul (máxima absorción a 595 nm). La unión es un proceso rápido (aproximadamente 2 minutos) y el complejo colorante-proteína se mantiene estable hasta una hora después de producido.
Como en esta reacción el CBB se une específicamente a las proteínas, es unbuen método de caracterización (aunque no de identificación). La reacción se prefiere a otras por su sensibilidad (mayor que la del biuret), lo que significa que, para una misma muestra, puede obtenerse un resultado positivo con el reactivo de Bradford pero negativo con el reactivo del biuret.
Dado que aún los materiales biológicos más sencillos poseen una composición química compleja, siempre sedebe de tener en cuenta la posibilidad de interferencias (positivas o negativas).
Objetivos
Conocer métodos de cuantificación de proteínas mediante reacciones químicas, como las reacciones de Biuret y Bradford.
Conocer la concentración de una muestra problema de proteínas mediante espectrofotometría, realizando una curva de calibración.
Procedimiento y materiales
Se utlizaron 6 tubosde ensayo a los cuales se les agregaron 200, 400, 600, 800 y 1000 µl de albúmina solución estándar u. El tubo 6 se utilizó como blanco, utlizando agua destilada, agregando 1 ml de ésta. Cada tubo se enrasó a 1 ml con agua destilada, esto se hizo agregando al primer tubo 800 µl, al segundo 600µl, al tercero 400 µl, al cuarto 200 µl y al quinto tubo no se le agregó agua destilada. A cada tubo se leagregaron 4 ml de reactivo de Biuret previamente preparado con una pipeta volumétrica de 5 ml. En otro tubo de ensayo se agregaron alrededor de 1 ml de muestra problema. Se agregaron 4 ml de reactivo de Biuret a los tubos y se dejó reposar por 30 minutos.
Mientras se dejaba desarrollar color en los tubos de la reacción de Biuret, Se procedió realizar el método de Bradford. En 6 tubos de ensayo...
Leer documento completo
Regístrate para leer el documento completo.