determinacion de proteínas
Páginas: 5 (1005 palabras)
Publicado: 3 de julio de 2013
4.1.2. Determinación de Proteínas por el Método Micro-Kjeldahl. (11,16,20,38)
El método de Kjeldahl fue introducido en 1883 por Johan Kjeldahl. En este método, la muestra se descompone con ácido sulfúrico concentrado en caliente para convertir el nitrógeno combinado en ion amonio. La solución resultante se enfría, se diluye y se alcaliniza. El amoníaco liberado se separa por destilación, serecoge en solución ácida, y por último se cuantifica por titulación. El método Kjeldahl puede ser dividido en tres pasos principales:
4.1.2.1 Digestión:
Consiste en la descomposición de nitrógeno en muestras orgánicas utilizando soluciones de ácidos concentrados. La ecuación general para la digestión de una muestra orgánica es como sigue:
La etapa crucial es la descomposición de la muestracon ácido sulfúrico, el cual oxida al carbono e hidrógeno a dióxido de carbono y agua; entonces el nitrógeno inorgánico en forma de ion amonio(NH4) es liberado. Durante la digestión, parte del H2SO4 es reducido a SO2 el cual a su vez reduce el material nitrogenado en amonio. Sin embargo, la transformación del nitrógeno depende del estado de combinación en la muestra original. El nitrógeno amínico yamídico se transforma cuantitativamente en ion amonio. Por el contrario, el nitrógeno en forma de grupos nitro, azo y azoxi pueden originar nitrógeno elemental o algunos óxidos de nitrógeno que se pierden en medio caliente.
Esta pérdida puede evitarse al tratar previamente la muestra con un agente reductor para formar productos que se comporten como el nitrógeno amínico o amídico. Enuno de estos tratamientos de prerreducción se agregan ácido salicílico y tiosulfato de sodio a la mezcla de ácido sulfúrico concentrado con la muestra. Poco después se lleva a cabo la digestión de la misma manera.
El problema de usar ácido sulfúrico solo para la digestión, es que el tiempo de digestión resulta demasiado largo, debido al lento tiempo de descomposición orgánica. La adición de unasal inorgánica al digerido eleva el punto de ebullición del H2SO4. La temperatura de la solución es de 330ºC; al adicionar una sal como el sulfato de potasio (K2SO4) se puede elevar la temperatura de la mezcla de digestión a 390 ºC o más; esto decrementa significativamente el tiempo de descomposición orgánica, disminuyendo el tiempo requerido para la digestión. Así también se hace uso decatalizadores; dentro de estos tenemos el óxido de mercurio que ha sido usado de forma efectiva; el mercurio forma un complejo con el ion amonio durante la digestión. La adición de tiosulfato o sulfuro de sodio después de la digestión y antes de la destilación puede romper el complejo y precipitar sulfuro de mercurio. Esto es importante desde un punto de vista de seguridad ya que los vapores de mercuriopueden escapar a la atmósfera durante el proceso de destilación; pero debido a los problemas ambientales sobre la manipulación y disposición del mercurio, se emplean otroscatalizadores; muchos métodos emplean sulfato de cobre, y se pueden preparar mezclas del sulfato de potasio y un catalizador ( por Ej. K2SO4 + CuSO4).
4.1.2.2 Destilación:
Adicionando un exceso de base a la digestión ácida paraconvertir amonio (NH4+) en amoníaco (NH3), seguido por ebullición y condensación de gas amoníaco en una solución fijadora.
La mezcla de digestión ácida es diluida y se hace fuertemente alcalina con hidróxido de sodio, liberando amoníaco como sigue:
La mezcla de digestión ácida es usualmente enfriada y diluida con agua libre de amonio. Solución de NaOH concentrado (50% P/V) es adicionadasuavemente por el cuello del frasco, para hacer al digerido fuertemente alcalino ( pH > 11).
La mayoría del amoníaco es destilado y atrapado en la solución fijadora en los primeros 5 o 10 minutos de ebullición; pero depende del volumen de la mezcla digerida; 15 a 150 ml de condensado puede ser colectado en el frasco recibidor para asegurar la completa recolección de nitrógeno.
Soluciones fijadoras:...
El método de Kjeldahl fue introducido en 1883 por Johan Kjeldahl. En este método, la muestra se descompone con ácido sulfúrico concentrado en caliente para convertir el nitrógeno combinado en ion amonio. La solución resultante se enfría, se diluye y se alcaliniza. El amoníaco liberado se separa por destilación, serecoge en solución ácida, y por último se cuantifica por titulación. El método Kjeldahl puede ser dividido en tres pasos principales:
4.1.2.1 Digestión:
Consiste en la descomposición de nitrógeno en muestras orgánicas utilizando soluciones de ácidos concentrados. La ecuación general para la digestión de una muestra orgánica es como sigue:
La etapa crucial es la descomposición de la muestracon ácido sulfúrico, el cual oxida al carbono e hidrógeno a dióxido de carbono y agua; entonces el nitrógeno inorgánico en forma de ion amonio(NH4) es liberado. Durante la digestión, parte del H2SO4 es reducido a SO2 el cual a su vez reduce el material nitrogenado en amonio. Sin embargo, la transformación del nitrógeno depende del estado de combinación en la muestra original. El nitrógeno amínico yamídico se transforma cuantitativamente en ion amonio. Por el contrario, el nitrógeno en forma de grupos nitro, azo y azoxi pueden originar nitrógeno elemental o algunos óxidos de nitrógeno que se pierden en medio caliente.
Esta pérdida puede evitarse al tratar previamente la muestra con un agente reductor para formar productos que se comporten como el nitrógeno amínico o amídico. Enuno de estos tratamientos de prerreducción se agregan ácido salicílico y tiosulfato de sodio a la mezcla de ácido sulfúrico concentrado con la muestra. Poco después se lleva a cabo la digestión de la misma manera.
El problema de usar ácido sulfúrico solo para la digestión, es que el tiempo de digestión resulta demasiado largo, debido al lento tiempo de descomposición orgánica. La adición de unasal inorgánica al digerido eleva el punto de ebullición del H2SO4. La temperatura de la solución es de 330ºC; al adicionar una sal como el sulfato de potasio (K2SO4) se puede elevar la temperatura de la mezcla de digestión a 390 ºC o más; esto decrementa significativamente el tiempo de descomposición orgánica, disminuyendo el tiempo requerido para la digestión. Así también se hace uso decatalizadores; dentro de estos tenemos el óxido de mercurio que ha sido usado de forma efectiva; el mercurio forma un complejo con el ion amonio durante la digestión. La adición de tiosulfato o sulfuro de sodio después de la digestión y antes de la destilación puede romper el complejo y precipitar sulfuro de mercurio. Esto es importante desde un punto de vista de seguridad ya que los vapores de mercuriopueden escapar a la atmósfera durante el proceso de destilación; pero debido a los problemas ambientales sobre la manipulación y disposición del mercurio, se emplean otroscatalizadores; muchos métodos emplean sulfato de cobre, y se pueden preparar mezclas del sulfato de potasio y un catalizador ( por Ej. K2SO4 + CuSO4).
4.1.2.2 Destilación:
Adicionando un exceso de base a la digestión ácida paraconvertir amonio (NH4+) en amoníaco (NH3), seguido por ebullición y condensación de gas amoníaco en una solución fijadora.
La mezcla de digestión ácida es diluida y se hace fuertemente alcalina con hidróxido de sodio, liberando amoníaco como sigue:
La mezcla de digestión ácida es usualmente enfriada y diluida con agua libre de amonio. Solución de NaOH concentrado (50% P/V) es adicionadasuavemente por el cuello del frasco, para hacer al digerido fuertemente alcalino ( pH > 11).
La mayoría del amoníaco es destilado y atrapado en la solución fijadora en los primeros 5 o 10 minutos de ebullición; pero depende del volumen de la mezcla digerida; 15 a 150 ml de condensado puede ser colectado en el frasco recibidor para asegurar la completa recolección de nitrógeno.
Soluciones fijadoras:...
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