Enzimas

Influencia del pH y la temperatura sobre la actividad de la B-fructofuranosidasa
Objetivos:
* Estudiar la influencia del pH sobre la velocidad de una reacción enzimática
* Estudiar la influencia de la temperatura sobre la velocidad de una reacción enzimática
Fundamento:
El efecto del pH en la cinética enzimática se debe a cambios en el estado de ionización de los componentes delsistema enzimático (enzima libre, complejo enzima sustrato, sustrato) y el efecto de la temperatura se debe a la desnaturalización de la proteina por sobrepasar la barrera energetica provocando el rompimiento de los enlaces de hidrogeno.
Por su carácter de proteína la enzima posee numerosos grupos ionizables. Si se varía la ionización de estos grupos a nivel del sitio activo o en algún puntolejano, pero que de algún modo altere el sitio activo se afecta el tipo de unión y estabilidad del complejo enzima-sustrato o la actividad catalítica misma.
Por este mismo motivo de que una enzima es una proteina la temperatura tambien afecta en su actividad enzimatica ya que a altas temperaturas la proteina se desnaturaliza por rompimiento de sus enlaces de hidrogeno que le de confierenla estructura secundaria y terciaria disminuyendo su actividad catalitica drasticamente.
Las enzimas son activas en un rango limitado de pH, y la mayoría de los casos, se puede encontrar un pH o una zona de pH en la cual la actividad enzimática es mayor, lo que se denomina pH óptimo. Hay que considerar además, que la enzima puede inactivarse por desnaturalización a pH extremos y que laestabilidad de la enzima frente a diversos agentes desnaturalizantes puede variar en función del pH. La naturaleza de la solución amortiguadora también puede interferir.
como toda reacción química la temperatura aumenta la velocidad de reacción catalizada por una enzima pero alcanza un punto en la que esta desciende ya que a altas temperaturas la enzima se inactiva por el calor

Materiales:
*Tubos de ensayo (7)
* Gradilla
* Pipetas
Reactivos:
* Glucosa Fructosa 0.01 M
* Sacarosa 0.45 M
* Preparación enzimática
* Buffer Citrato 0.2 M
* Reactivo 3,5-dinitrosalicilato

Instrumentación:

* Baños de agua termostatizado a diferentes temperaturas de trabajo (30-40-50-60-70-100 °C)
* Espectrofotometro

Metodología:
* Determinación de lavelocidad de la hidrólisis de la sacarosa por la b-fructofuranosidasa, a diferentes pH.
* Determinación de la velocidad de la hidrólisis de la sacarosa por la β-fructofuranosidasa a diferentes temperaturas

Procedimiento:
* Preparar a partir de citrato 0.2 M, soluciones amortiguadoras de por lo menos 6 valores de pH diferentes (2,4: 3,4: 4,4: 5,4: 6,4: 7,4).
* Tomar como centro de laescala de pH el pK del ácido de la solución amortiguadora implicada.
* Disponer de una serie de tubos de ensayo de igual número que el de los valores de pH elegidos y un blanco (7 tubos) rotulados.
* Agregar a cada tubo 1 ml de la solución glucosa fructosa y 1 ml de preparacion enzimatica
* Poner los tubos en el baño termostatizado a la temperatura seleccionada (realizarlo a las 5temperaturas seleccionadas 30:40:50:60:70 cada grupo seleccionar 2 temperaturas y luego compartir los resultados para graficar)
* comenzar a adicionar 1 ml de buffer citrato al diferentes pH con un intervalo de 30 segundos por tubo y dejar incubar por 5 minutos cada tubo una vez adicionado el buffer
* Sacar los tubos del baño de agua a la temperatura seleccionada y cambiarlos a un bañoa 100°
* Detener la reacción agregando 2,0 mL de solución 3,5-dinitrosalicilato. Desarrollar el color incubando todos los tubos en baño hirviente durante 5 minutos. Enfriar. Completar con agua destilada a volumen de 20 mL.
* Leer la Absorbancia en el espectrofotómetro con la longitud de onda apropiada (540 nm).

Observaciones:
Longitud de onda: 540 nm
Coloración de la solución:...