Enzimología

“LABORATORIO DE BIOQUÍMICA I”

Informe Nº2, 3 y 4 Enzimología



Integrantes: Vanessa Bozo
Claudia IturriagaProfesores: José Miguel Villarreal
Bernardo Collao

Carrera: Bioquímica

Curso: BIO-267 LASección: 1

Fecha de entrega:

INTRODUCCIÓN

OBJETIVO

METODOLOGIA

RESULTADOS

* PARTE I: Curva de calibración y determinación del rango lineal.
A.) Curva de calibración para la formación de p–nitrofenol:
Las absorbancias medidas a 405 [nm] de las diferentes disoluciones de p-nitrofenolpreparadas, se observan en la siguiente tabla:

Tabla N°1: Absorbancia de disoluciones medidas a 540 [nm]
Tubo | Cantidad de producto formado p-nitrofenol (mol) | Absorbancia |
1 | 0.06 | 0.195 |
2 | 0.12 | 0.367 |
3 | 0.18 | 0.536 |
4 | 0.24 | 0.707 |
5 | 0.3 | 0.869 |

* Cálculo de los mol de p-nitrofenol:
Ejemplo para el tubo 1 dónde se tomó 1 mL de p-nitrofenol 60M, y sellevaron a 6mL. totales correspondientes a la suma del p-nitrofenol y el NaOH:

Se repitió la operación para cada una de las soluciones.

* A continuación, se graficó la Absorbancia versus la cantidad de p-nitrofenol.

Gráfico N°1: Absorbancia v/s Cantidad de p-nitrofenol.

B.) Determinación del rango lineal de la fosfatasa ácida del germen de trigo por medio de un ensayo de tiempo fijo.Es importante saber que el producto formado del p-nitrofenil fosfato (p-NPP) con la enzima fosfatasa, es el p-nitrofenol, éste en solución alcalina se isomeriza a p-nitrofenolato, que es el que absorbe luz en la región de los 405nm.
Las absorbancias medidas a 405 [nm] de las diferentes disoluciones (p-NPP) preparadas, se observan en la siguiente tabla:
Tabla N°2: Absorbancia de disolucionesmedidas a 405 [nm]

Tubo | Tiempo | Tiempo en minutos | Absorbancia | Cantidad de producto formado ( mol) |
1 | 0 | 0 | BLANCO | - |
2 | 5’13’’ | 5.22 | 0.045 | 0.191 |
3 | 10’14’’ | 10.23 | 0.104 | 0.441 |
4 | 15’07’’ | 15.12 | 0.132 | 0.550 |
5 | 20’05’’ | 20.08 | 0.181 | 0.767 |
6 | 25’07’ | 25.12 | 0.213 | 0.903 |
7 | 30’25’’ | 30.42 | 0.264 | 1.119 |

* Cálculo de los µmolde p-nitrofenol:
Ejemplo para el tubo 2 dónde se tomó 0.5mL de la solución enzima-sustrato, y se llevaron a un tubo con 5.5 mL. de NaOH, con 6 mL. totales. En este punto el cálculo de la cantidad de producto de formado se realizó a través de la ley de Lambert – Beer, dónde el valor de corresponde a la pendiente del gráfico 1, l es el paso óptico que corresponde a 1cm y A la absorbancia que esla obtenida a partir de cada solución. La multiplicación *12 se debe a que hay que tomar en cuenta el factor dilución que corresponde a 12.

* A continuación, se graficó la Absorbancia versus la cantidad de p-nitrofenol.
Gráfico N°2: Cantidad de producto formado (p-nitrofenol) versus tiempo.

* El rango lineal se consideró de 5 a 15 minutos, para términos de laboratorio se decidiótrabajar a tiempo fijo 10 minutos ya que era el término medio.

* PARTE II: Determinación de parámetros cinéticos.

A.) Cálculos y tabla de absorbancias para tiempo 10 min.
Las absorbancias medidas a 405[nm] de las diferentes disoluciones preparadas, se observan a continuación en la siguiente tabla:

Tabla N°3: Absorbancia de disoluciones medidas a 405[nm]
Tubo | Absorbancia |...