Farmacia- bioquimica
Páginas: 9 (2189 palabras)
Publicado: 21 de octubre de 2010
MARCO TEORICO
La separación y cuantificación de una fracción de proteínas es un método espectrofotométrico, colorimétrico, oxido-reductivo (método de lowry) y de complejación, utilizados para la cuantificación de proteínas; por ejemplo el método de biuret se basa en detectar la presencia de péptidos y otros compuestos con dos o más enlaces peptídicos en sustancias de concentracióndesconocida, en una longitud de onda de 540 nm.
En este método es necesario utilizar un reactivo de biuret que está conformado de hidróxido potásico (KOH) y sulfato cúprico (CuSO4), junto con tartrato de sodio y potasio (KNaC4O6·4H2O). El reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de proteínas, y vira a rosa cuando se combina con polipéptidos de cadena corta. El Hidróxido de Potasio noparticipa en la reacción, pero proporciona el medio alcalino necesario para que se dé lugar a la reacción.
Por otro lado, el método lowry es el más ampliamente usado, puesto que su sensibilidad (0.01-1 mg/ml) es moderadamente constante de proteína a proteína, lo cual lo hace aceptable cuando se trata de determinación absoluta en mezclas de proteínas o muestras problema.
Este método es mucho mássensible que el de Biuret. Este método utiliza una solución que contiene cobre (la cual aumenta la sensibilidad en la determinación de proteínas) y un reactivo, llamado Reactivo de Folin, que se reduce en presencia de proteínas. Las especies reducidas cambian su color hacia el azul y son capaces de ser leídas por el espectrofotómetro para encontrar su absorbancia.
Y por ultimo nos encontramos con elmétodo de Bradford, la prueba para determinar proteínas por el método de Bradford se basa en el acoplamiento del colorante con la proteína y se determina colorimétricamente, existe una relación directa entre el desarrollo del color y la concentración de proteínas.
Con este método las proteínas tienen una capacidad de absorción máxima de 465, eso cambia a 595 nm cuando el colorante esta unido alas proteínas. Este es el principio básico del azul de Coomasie para la determinación de proteínas por Bradford, el método representado es una modificación de Bradford con los cambios sugeridos por Read and Northcote, la modificación ocasiona un incremento en la concentración del tinte, desarrollando una mayor sensibilidad y una marcada disminución en la variabilidad del color con diferentesproteínas lo cual es la principal desventaja del método.
Puesto que la separación y cuantificación de las proteínas está basada en métodos espectrofotométricos, es necesario entender que nos regimos bajo un parámetro fundamental la LEY DE BEER donde la absorbancia es directamente proporcional a la concentración de la especie absorbente y al camino óptico; es por esta razón que podemos asociar lalecturas de absorbancia a una concentración de analito.
RESUMEN DE LAS PRÁCTICAS
Método de Biuret:
Se inicia con la preparación de la muestra a partir de un 1 ml de suero fetal bovino, mas H2O destilada, y 5mL de solución saturada de sulfato de amonio ((NH4)2SO4), un reposo y centrifugación, seguido de la separación del sobrenadante (desechado) y un precipitado, el cual se re-disuelve con 5.0 mlde solución NaCl 0.9 %, esta muestra se utiliza para la determinación de las globulinas.
Luego se procede a preparan 4 soluciones, en la 1ra es una solución salina o blanco, la cual solo contendrá 1.0 ml de NaCl 0.9 mas el reactivo de biuret; la 2da solución será la patrón del albumina que será 1.0 ml de solución patrón o albumina mas el reactivo de biuret; la 3ra solución será de 1.0 ml deglobulinas mas 4.0 ml de reactivo de biuret; la 4ta solución es de 1.0 ml de proteínas totales mas 4.0 ml de reactivo de biuret; se dejan reposar por 30 min. En oscuridad y se procede a leer absorbancia a 540nm.
El método de Lowry:
se prepara un blanco, una muestra problema que tiene 1.0 ml de 1/20 S.F.B., mas 3 ml de NaCl 0.9; se prosiguió con una curva de calibración con 8 tubos con solución...
La separación y cuantificación de una fracción de proteínas es un método espectrofotométrico, colorimétrico, oxido-reductivo (método de lowry) y de complejación, utilizados para la cuantificación de proteínas; por ejemplo el método de biuret se basa en detectar la presencia de péptidos y otros compuestos con dos o más enlaces peptídicos en sustancias de concentracióndesconocida, en una longitud de onda de 540 nm.
En este método es necesario utilizar un reactivo de biuret que está conformado de hidróxido potásico (KOH) y sulfato cúprico (CuSO4), junto con tartrato de sodio y potasio (KNaC4O6·4H2O). El reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de proteínas, y vira a rosa cuando se combina con polipéptidos de cadena corta. El Hidróxido de Potasio noparticipa en la reacción, pero proporciona el medio alcalino necesario para que se dé lugar a la reacción.
Por otro lado, el método lowry es el más ampliamente usado, puesto que su sensibilidad (0.01-1 mg/ml) es moderadamente constante de proteína a proteína, lo cual lo hace aceptable cuando se trata de determinación absoluta en mezclas de proteínas o muestras problema.
Este método es mucho mássensible que el de Biuret. Este método utiliza una solución que contiene cobre (la cual aumenta la sensibilidad en la determinación de proteínas) y un reactivo, llamado Reactivo de Folin, que se reduce en presencia de proteínas. Las especies reducidas cambian su color hacia el azul y son capaces de ser leídas por el espectrofotómetro para encontrar su absorbancia.
Y por ultimo nos encontramos con elmétodo de Bradford, la prueba para determinar proteínas por el método de Bradford se basa en el acoplamiento del colorante con la proteína y se determina colorimétricamente, existe una relación directa entre el desarrollo del color y la concentración de proteínas.
Con este método las proteínas tienen una capacidad de absorción máxima de 465, eso cambia a 595 nm cuando el colorante esta unido alas proteínas. Este es el principio básico del azul de Coomasie para la determinación de proteínas por Bradford, el método representado es una modificación de Bradford con los cambios sugeridos por Read and Northcote, la modificación ocasiona un incremento en la concentración del tinte, desarrollando una mayor sensibilidad y una marcada disminución en la variabilidad del color con diferentesproteínas lo cual es la principal desventaja del método.
Puesto que la separación y cuantificación de las proteínas está basada en métodos espectrofotométricos, es necesario entender que nos regimos bajo un parámetro fundamental la LEY DE BEER donde la absorbancia es directamente proporcional a la concentración de la especie absorbente y al camino óptico; es por esta razón que podemos asociar lalecturas de absorbancia a una concentración de analito.
RESUMEN DE LAS PRÁCTICAS
Método de Biuret:
Se inicia con la preparación de la muestra a partir de un 1 ml de suero fetal bovino, mas H2O destilada, y 5mL de solución saturada de sulfato de amonio ((NH4)2SO4), un reposo y centrifugación, seguido de la separación del sobrenadante (desechado) y un precipitado, el cual se re-disuelve con 5.0 mlde solución NaCl 0.9 %, esta muestra se utiliza para la determinación de las globulinas.
Luego se procede a preparan 4 soluciones, en la 1ra es una solución salina o blanco, la cual solo contendrá 1.0 ml de NaCl 0.9 mas el reactivo de biuret; la 2da solución será la patrón del albumina que será 1.0 ml de solución patrón o albumina mas el reactivo de biuret; la 3ra solución será de 1.0 ml deglobulinas mas 4.0 ml de reactivo de biuret; la 4ta solución es de 1.0 ml de proteínas totales mas 4.0 ml de reactivo de biuret; se dejan reposar por 30 min. En oscuridad y se procede a leer absorbancia a 540nm.
El método de Lowry:
se prepara un blanco, una muestra problema que tiene 1.0 ml de 1/20 S.F.B., mas 3 ml de NaCl 0.9; se prosiguió con una curva de calibración con 8 tubos con solución...
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