Genetica bacteriana y viral - enzimas

Genética Bacteriana y Viral
Informe semanal nº 1

31/03/2011

ENZIMAS

Enzimas modificadoras del ADN

Todas las ADN polimerasas adicionan deoxinucleótidos al extremo 3’ OH libre. La síntesis se realiza de manera exclusiva en la dirección 5’-3’ con respecto a la hebra sintetizada. Cada nucleótido que es incorporado durante la polimerización es complementario a la hebra. La reacciónrequiere de los 4 dNTPs e ion magnesio. Las principales ADN polimerasas poseen actividad exonucleasa 3’-5’ inherentes asociada con la actividad polimerasa. Sin embargo, algunas también poseen una actividad exonucleasa 5’-3’ como es el caso de la ADN polimerasa 1 de E. Coli.

ADN polimerasa 1: esta enzima es proveniente de la E. coli, la cual la utiliza para replicar su propio ADN. Para quese lleve a cabo la reacción se necesita una cadena simple hebra de desoxirribonucleotido monofosfato, más uno de los cuatro desoxirribonucleotidos trifosfato, extendiendo la cadena, liberando un PPi. Además se necesita un primer o cebador para que la enzima se una y sintetice la nueva hebra. A diferencia de la ARN polimerasa que no lo necesita. La dirección de síntesis es 5´- 3´.
Esta polimerasaposee tres tipos de actividades:
a) Replicativa: 5´- 3´
b) Exonucleasa: 3´- 5´
c) Exonucleasa: 5´- 3´

Por ende, polimeriza y digiere, por esto, va corrigiendo los posibles errores que cometa durante la polimerización del ADN. Estas actividades tienen un origen evolutivo, y es aprovechado por los biólogos moleculares como herramienta en el laboratorio (clonado, reacción en cadena de lapolimerasa, determinación de secuencias, etc.).
Algo importante que debemos tener en cuenta a la hora de elegir una enzima es su procesividad, que se define como el número de nucleótidos que puede sintetizar sin desprenderse, o sea que será tanto más procesiva cuanta cadena más larga pueda sintetizar sin desprenderse.

T7 ADN polimerasa: es una enzima proveniente del fago T7, posee unaalta actividad exonucleasa 3´ - 5´, además de su actividad polimerasa. Se incuba a 37º C durante 20 minutos. La reacción se detiene agregando EDTA o bien calentando a 75º C durante 10 minutos. El volumen de reacción, la concentración de los 4 dNTPs, la cantidad de ADN y enzima, la temperatura de reacción, dependen de las condiciones individuales de las prácticas. Por su elevada procesividad deemplea para la determinación de secuencias de ADN, por esta característica posee una versión comercial llamada secuenasa.

TAQ ADN polimerasa: es la ADN polimerasa 1 pero proveniente de Termus acuáticus y es la enzima de elección para las reacciones de PCR. Su actividad óptima se encuentra entre los 75º a 80º C. y no aparece la actividad exonucleasa 3´ - 5´. Es un polipéptido de cadena simpleque posee alta procesividad.

Transcriptasa inversa: es la única enzima ARN dependiente. Esta enzima realiza el mismo trabajo que la ADN polimerasa pero empleando como molde ARN. Son derivadas de retrovirus. La ADN sintetizada a partir de un molde de ARN, es conocido como ADN copia (ADNc). Esta enzima incorpora dNTPs en forma lenta (aprox. 5 nucleótidos/segundo).

T4 ADN ligasa:proveniente del fago T4, utiliza ATP como cofactor, cataliza la reparación de dobles cadenas de ADN cortadas con enzimas de restricción que produzcan extremos romos en las hebras. La reacción se detiene adicionando EDTA o calentando a 75º C durante 10 minutos. El volumen de reacción, la cantidad de ADN, la temperatura y tiempo de reacción dependen de cada caso en particular.

E. coli ADNligasa: proveniente de Escherichia coli, cataliza la reparación de dobles cadenas de ADN cortadas con enzimas de restricción que generen extremos cohesimos. Esta enzima utiliza NAD como cofactor.

Polinucleótido quinasa (PNK): fosforila el extremo 5´ de las moléculas de ADN, por lo que tiene importancia a la hora de querer realizar una marcación en este extremo.

Fosfatasa alcalina...