Hibridacion in situ de rna

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HIBRIDACION IN SITU DE MRNA
Un tejido se compone de distintos tipos celulares, cada uno de los cuales expresa un conjunto de genes. Por ello, incluso dos células adyacentesen un mismo tejido pueden expresar distintos genes. En algunos casos es pues necesario estudiar la localización de un transcrito para conocer a detalla su expresión.
La hibridación in situ de los mrna consiste en analizar lapresencia de una secuencia determinada en la población de mrna celulares por hibridación molecular sobre cortes de tejidos. El tejido u órgano se fija químicamente, se incluye en parafina, se corta en secciones finas y se pone en contacto con la sonda. Generalmente, las sondas utilizadas son RNA marcados ( ribosondas). Las ribosondas se obtienen por transcripción in vitro de la cadenacomplementaria al mrna a detectar en presencia de UTP marcado. El UTP puede marcharseradiactiva (generalmente con [35s] UTP o mas recientemente con [33p] o químicamente digoxigenina).
Cuando la sonda es radioactiva, después de la hibridación y los lavados se cubre el corte con emulsion fotográfica translucida liquida. Esta emulsion se solidifica y la radioactividad puede impresionar localmente la emulsion.El análisis, después del revelado, se realiza por microscopia óptica, observándose la superposición de las estructuras celulares y los precipitados de plata.en el marcaje químico de ribosondas se utiliza generalmente Dutp ACOPLADO A UNA MOLECULA DE DIGOXIGENINA (Dig) un hapteno esterooideo. Después de la hibridación y los lavados el hibrido RNA/RNA se detecta con un anticuerpoanti-digoxigeninaasociado a la fosfatasa alcalina ( PAL).
La actividad enimatica de la PAL se puede detectar gracias a la formación de un precipitado coloreado. La observación de los cortes de tejido al microscopio permite visualizar este precipitado y deducir de ello la localización celular del transcrito.
De una manera análoga al caso de las hibridaciones moleculares sobre filtro los lavados adecuados permiteneliminar las hibridaciones inespecíficas.los hibridos pueden revelarse y los cortes se examinan al microscopio óptico. Se pueden usar distintos métodos de tinción para delimitar las estructuras celulares pudiéndose determinar las células que acumulan los mrna de interés.
La hibridación in situ de los mrna ha resultado ser muy útil para el análisis de genes regulados durante el desarrollo dedrosophila permitiendo delimitar los sectores en los que la acumulación diferencial de mRNA (de manos y bicoid por ejemplo) promueve la diferenciación de distintos tejidos en el embrión. En el caso de tejidos muy jóvenes, translucidos y constituidos por pocos tejidos distintos, la hibridación in situ se puede realizar directamente sobre los tejidos, sin necesidad de realizar cortes histológicos.CONSTRUCCION DE UNA GENOTECA DE DNA GENOMICO
La construcción de una genoteca de DNA genómico es útil, por ejemplo, cuando se quiere caracterizar una ausencia genómica determinada, establecer el mapa físico de un genoma o secuenciar, total o parcialmente un genoma.
Una genoteca de DNA genómico es un conjunto de vectores recombinante que contiene un fragmento del genoma de la especie estudiada. Lacontruccion de una genoteca de DNA genómico consta de las siguientes etapas: 1) aislamiento del DNA genómico de la especie de interés; ii) digestión del DNA con un enzima de restricción que permita obtener fragmentos de un tamaño compatible con el vector: iii) clonación de los fragmentos en un vector; (iv) integración de los vectores recombinantes en un microorganismo para su multiplicación.losvectores de tipo fago son mas utiles para la clonación de secuencias genómicas particulares, mientras que los cosmidos y los YAC y BAC se utilizan en la caracterización de genomas enteros. La genoteca obtenida por este proceso contiene millones de clones recombinantes.
Dado que el DNA genómico es escencialmente igual en todas las células de un organismo, se puede usar cualquier tejido para obtener...
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