Induccion de mutantes en e. coli

OBJETIVOS.
Introducir el manejo de algunas técnicas para producir mutaciones.
Analizar algunos parámetros que caracterizan el proceso de mutación, como la frecuencia de mutación y la relación dosis - respuesta.
Caracterizar el daño producido por la luz ultravioleta e Hidroxilamina, mediante pruebas de reversión.

Mutación, es el cambio en la secuencia de bases del ácido desoxirribonucleico(ADN) de un organismo, y que además es capaz de ser heredable a su descendencia. Pueden distinguirse dos clases de mutaciones, las seleccionables y las no seleccionables. Un ejemplo de mutación no seleccionable, es la pérdida de color en un organismo pigmentado, no tiene ventajas ni desventajas sobre las colonias silvestres. Las seleccionables, proporcionan al mutante una ventaja bajo ciertascondiciones ambientales, son un instrumento genético muy poderoso que permite el aislamiento de un solo mutante a partir de una población de millones o de miles de millones de organismos originales.
Prácticamente cualquier característica de un microorganismo puede combinarse por mutación. Las mutantes nutricionales pueden detectarse por la técnica de réplica de placa.
Un mutante nutricional querequiere un factor de crecimiento se suele denominar auxótrofo y la cepa silvestre (original) la que se denomina protótrofo.
Las mutaciones pueden ser espontáneas o inducidas. Las primeras son aquellas que surgen normalmente por razones desconocidas, tales errores ocurren con una frecuencia de mutación de 10-8 a 10-10. Las mutaciones inducidas surgen como consecuencia de la exposición a mutágenos(Tabla 1) químicos, biológicos o físicos, aumentando con ello la frecuencia de mutación de 10-4 a 10-7.

Tabla 1: Ejemplos de mutágenos y su mecanismo de acción.
MUTÁGENO | ACCIÓN |
Químicos |
9-aminoacridina | Inserción y deleción de pares de bases. Modifica el marco de lectura. |
Estreptomicina | Antibiótico que causa lectura errónea de codónes. Modifica al fenotipo porque altera lasíntesis de proteínas. |
Nitrosoguanidina | Agente quelante, genera un proceso de oxidación. |
5–Bromouracilo | Análogo de base parecido a la Timina y se incorpora como está en la cadena del DNA, comportándose como citosina, logrando una transición GC-AT. |
Hidroxilamina | Modificador de bases (unidireccional) reacciona casi exclusivamente con la citosina, provoca sustituciones de transiciónde GC-AT. |
ICR-170 | Agente alquilante. |
Físico |
Luz Ultravioleta | Forma enlaces covalentes entre restos de pirimidinas adyacente en la misma cadena o cadena complementaria, formando dímeros de pirimidinas. |

Entre los mutágenos químicos se pueden citar los análogos de bases del ADN (como la 2-aminopurina), moléculas que se parecen estructuralmente a las bases púricas o pirimídicaspero que muestran propiedades de apareamiento erróneas; los agentes alquilantes como la Nitrosoguanidina, que reacciona directamente con el ADN originando cambios químicos en una u otra base y produciendo también apareamientos erróneos, por último los agentes intercalantes como las acridinas, que se intercalan entre dos pares de bases del ADN, separándolas entre sí.
Como mutágenos biológicospodemos considerar la existencia de transposones o virus capaces de integrarse en el genoma. Por último los mutágenos físicos, radiaciones ionizantes (rayos x, rayos cósmicos y rayos gamma) y no ionizantes (sobre todo la radiación ultravioleta), también inducen mutaciones en el ADN; las primeras se originan por los radicales libres que reaccionan con el ADN inactivándolo y las segundas aparecen comoconsecuencia de la formación de dímeros de pirimidinas en el ADN, es decir, como consecuencia de la unión covalente de dos bases pirimidínicas adyacentes.
En cualquier caso, las mutaciones pueden ser: puntuales (cuando afectar a un par de bases) o mutaciones que afectan a muchos pares de bases. Cuando es puntual, el resultado puede ser una proteína defectuosa (entonces la mutación se conoce como...