Informe bioquimica

| PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CHILE-------------------------------------------------
FACULTAD DE QUIMICA-------------------------------------------------
DEPARTAMENTO DE QUIMICA-FÍSICA |
CURSO
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA QIM-117

SECCION
01
PROFESOR
Jacqueline Alea

FECHA EJECUCIÓN
22 de marzo de 2011

INFORME EXPERIENCIA N° 1
AISLACION Y PURIFICACION DE UNA PROTEINA DE LALECHE:
-LACTOALBUMINA

INTEGRANTES
Marco Antonio Palominos
Gonzalo Fernando Pino
1° SEMESTRE, 2011

INTRODUCCIÓN
La α-lactoalbúmina (α-LA) es una de las proteínas más abundantes en el suero de la leche de numerosos mamíferos, junto a la β-lactoglobulina y la caseína; es una proteína globular de 123 aminoácidos, estabilizados por cuatro puentes disulfuro y de vital importancia por lafijación al calcio que tiene –la estructura terciaria se estabiliza por medio de este catión-, y presente en la biosíntesis de lactosa, presenta un punto isoeléctrico entre 4,2 y 4,5. En esta práctica se realizará la aislación de esta proteína a través de la precipitación del resto de las proteínas presentes por cambios de acidez en el medio y la cuantificación de ésta según el método de Buriet.FUNDAMENTOS
Como primer paso para la aislación, es necesario eliminar la caseína del resto del suero de la leche, esto se hace mediante calentamiento y acidificación de pH del medio, quedando en solución las proteínas restantes.
Luego, para poder separar la α-LA del resto de las proteínas presentes en la muestra, se lleva el filtrado a pH 4,2 y agregando una sal que forme complejos con el Ca2+,deformando la estructura de la proteína y haciéndola insoluble, por lo que precipita la lactoalbúmina estando en su punto isoeléctrico, mientras que el resto de las proteínas siguen en solución.
Por ultimo para poder efectuar la cuantificación de la α-LA, se redisuelve la proteína llevando agregando hidróxido de sodio hasta llegar a pH cercano a 8,5.
El método de Biuret permite determinar laconcentración de proteínas de una muestra. Se basa en la reacción que tiene lugar entre los iones de cobre del reactivo de Biuret y los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos de las proteínas.
Se produce un complejo de color azul que absorbe entre 540 y 550nm. La intensidad del color es una medida directa de la concentración del complejo y, por tanto, de la concentración de proteínapresente en la muestra. Para ello se recurre a una muestra patrón de concentración conocida y extrapolando la recta entregada por la absorbancia de cada una de las soluciones se puede determinar la concentración de la muestra problema y así, la concentración de α-LA
El rango de concentraciones de proteína que se pueden medir mediante este ensayo está comprendido entre 0,5 y 10 mg de proteína/ml
PARTEEXPERIMENTAL
* Soluciones y reactivos
*
* Leche descremada
* Ácido Acético 10% m/m (C2H4O2)
* Acido Clorhídrico concentrado (HCl)
* Hidróxido de sodio 1M (NaOH)
* Citrato trisódico 1M (Na3C6H5O7)
* Tartrato sódico-potásico (NaK×C4H4O6×4H2O)
* Hidróxido de sodio 10% p/v (NaOH)
* Disolución estándar de proteína

* Materiales*
* Vaso de precipitado de 100 y 50mL
* Bureta
* Pipeta
* Mechero
* Balanza
* Embudo
* Centrífuga
* Espectrofotómetro
* pH-metro

PROCEDIMIENTO
Aislación de la α-lactoalbúmina 1,2,
1. Colocar 50mL de leche descremada en un vaso precipitado de 100mL y calentar hasta 40°C; agregar lentamente acido acético diluido. Una vezque no se forme más precipitado, alrededor de 10 minutos
2. Filtrar la solución, y pasar el filtrado a un vaso de 50mL; agregar 15mL de citrato trisódico y lentamente HCL concentrado hasta alcanzar pH 4,2 y centrifugar a 2000rpm por 30 minutos
3. Al precipitado agregar 10mL de agua destilada y agregar NAOH, 1N hasta alcanzar un pH de 6,5; mezclar la solución hasta que quede homogénea,...