Introducción a la microscopía

Material de Apoyo – Org. Celular y Tisular – CERP Centro – Prof. Alexander Cantou – 2009 (Tomado de Actividades Prácticas – Cátedra de Biología Celular – Facultad de Ciencias)

INTRODUCCIÓN A LA MICROSCOPÍA Parte 3
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA:

Los componentes estructurales de las células pueden observarse con alta resolución mediante microscopía electrónica. El microscopio electrónico resultauna herramienta indispensable a la hora de entender el contexto ultraestructural en el cual ocurren los procesos celulares y subcelulares. Al estudiar los fundamentos de la microscopía óptica, expresamos el límite de resolución mediante la ecuación de Abbe (LR = 0.61/AN). De la misma se deduce que disminuyendo la longitud de onda se logra mejorar el límite de resolución de un microscopio. Una formade lograr esto es utilizando un haz de electrones en lugar de luz como fuente de radiación. La longitud de onda de un haz de electrones dependerá de la velocidad de los mismos, a medida que su velocidad aumenta, disminuye la longitud de onda y pueden resolverse elementos más pequeños. En un microscopio electrónico, un haz de electrones es acelerado en condiciones de vacío mediante diferencias depotencial que van desde 10.000 a 100.000 voltios. Por ejemplo a 60.000 voltios, la longitud de onda del haz de electrones será de 0.005 nm y el límite de resolución será de 0.003 nm, lo cual se localiza en la escala atómica. Este límite de resolución es sin embrago inalcanzable ya que las aberraciones esféricas de las lentes obligan a disminuir la apertura numérica de las mismas, por lo cual ellímite de resolución real se encuentra entre 0.1-0.5 nm. El microscopio consta básicamente de una columna hueca en cuyo extremo superior se localiza un filamento de tungsteno que actúa como fuente de electrones. El haz de electrones generado es enfocado por una serie de electroimanes que actúan como lentes condensadoras y objetivas. La muestra se coloca en un soporte que se introduce en el trayectodel haz de electrones. Si estos no se encuentran con materia durante su trayectoria, no serán dispersados y llegaran a impactar en una pantalla en la parte inferior de la columna, observándose una estructura brillante. Si en cambio, los electrones chocan con alguna estructura durante su trayectoria, serán dispersados, no impactarán en la pantalla y se observará una estructura oscura. La dispersiónde electrones al entrar en contacto con la muestra, dependerá de su estructura (densidad atómica de sus componentes y número de átomos por unidad de área). Dado que

los átomos que componen la materia orgánica son en su mayoría de peso atómico bajo (C, H, O, N, etc), el material biológico posee poca capacidad de dispersión de electrones. Para lograr entonces un buen contraste, la muestra debeser primero fijada (generalmente se emplea glutaraldehído y tetróxido de osmio), luego cortada (corte ultrafinos de entre 40 y 70 nm) y por último teñida con metales pesados (acetato de uranilo o citrato de plomo) que le confieren mayor densidad a las estructuras celulares. Existen básicamente dos tipos de microscopio electrónico: en los microscopios electrónicos de transmisión (MET) se obtiene unaimagen de los electrones “transmitidos” a través del espécimen, en los microscopios electrónicos de barrido (MEB) se genera la imagen correspondiente a los electrones que rebotan en la muestra, más la de los electrones secundarios emitidos por ella. Estos electrones son capturados por un detector generando una imagen tridimensional (Figura 8).

Figura 8: Diagrama esquemático de funcionamientode microscopios electrónicos de transmisión (MET) y de barrido (MEB).

Figura 9: Microscopios electrónicos de transmisión (izquierda) y de barrido (derecha) Principales estrategias metodológicas para la preparación y observación de material al microscopio electrónico: La metodología escogida para preparar las muestras, va a depender del tipo de material y del tipo de información que busquemos...