Mutación Con 2-Aminopurina

Mutación con 2-Aminopurina
Objetivos
• El objetivo de esta práctica es obtener mutantes resistentes a la rifampicina en cepas de Escherichia coli mediante mutagénesis química con 2-aminopurina.
• La 2-aminopurina es una análogo de base de la adenina que provoca que un par A:T pase a ser un par G:C.
• También se analizará la capacidad mutagénica de la 2-aminopurina, así como el rendimiento dela mutagénesis.
Materiales y Métodos
• Para realizar dicho experimento se utilizaron diferentes cepas de E.coli de la serie CSH crecidas en LB líquido, en nuestro caso fue la cepa 103. Estas cepas fueron crecidas previamente y se inocularon 10µl de cada cepa en medios con LB líquido y otros 10µl en medios con LB líquido y 2-aminopurina a una concentración de 700µg/ml. Dichos tubos se incubarondurante 24 horas en estufa a 37ºC.
• Al día siguiente se observaron los tubos y no presentaban crecimiento debido a un fallo en la estufa que hizo que la temperatura de la incubación no fuera la adecuada para el crecimiento de las bacterias. Por esta razón, esos mismos tubos se volvieron a incubar durante 24 horas más, a 37ºC.
• Tras la incubación se observo el crecimiento en los tubos y sellevaron a cabo las siguientes diluciones, utilizando suero salino:
* Del tubo de LB líquido se hicieron diluciones decimales hasta la dilución 10-7.
* Del tubo de LB con 2-AP se hicieron diluciones decimales hasta la 10-6.
• A partir de estos tubos se sembraron, con asa de Drigalsky, diferentes placas:
* Del tubo de LB se sembraron 100µl de las diluciones 10-4, 10-5, 10-6 y 10-7 enplacas de LB. Y 100µl de las diluciones 10-1 y 10-2 en medios con LB-Rifampicina.
* Del tubo de LB y 2-AP se sembraron 100µl de las diluciones 10-3, 10-4, 10-5 y 10-6 en placas de LB, y 100µl de las diluciones 10-1 y 10-2 y del tubo original en placas con LB-Rifampicina.
• Las placas se incubaron durante 24 horas a 37ºC y al día siguiente se contaron las colonias en las placas quepresentaban entre 30 y 500 colonias para obtener los resultados.
• Debido a los problemas ocurridos durante la incubación de los tubos se procedió a la repetición del experimento. Para ello se procedió del mismo modo, se sembró un tubo de LB y otro tubo de LN+2AP y se incubaron a 37⁰ durante 24horas.
• Tras la incubación se observo crecimiento en ambos tubos, siendo mayor la turbidez en el tubo de LB. Sehicieron las mismas diluciones que en el otro experimento y se sembraron placas de LB y LB-Rifampicina a partir de ambos tubos.
Resultados
* A continuación se muestran los resultados obtenidos tras 48 horas de incubación de los tubos de LB y LB con 2-aminopurina.
• Número de colonias por placa:
* Placas sembradas a partir del tubo de LB:
* Dilución 10-7 en placa de LB: 12colonias, no se utiliza porque son pocas.
* Dilución 10-6 en placa de LB: 58 colonias.*
* Dilución 10-5 en placa de LB: 421 colonias.*
* Dilución 10-4 en placa de LB: Colonias incontables, más de 500.
* Dilución 10-1 en placa de LB-Rifampicina: 1colonia.*
* Dilución 10-2 en placa de LB-Rifampicina: Ninguna colonia.
* Placas sembradas a partir del tubo de LB con2-AP:
* Dilución 10-6 en placa de LB: 12 colonias.
* Dilución 10-5 en placa de LB: 163 colonias.*
* Dilución 10-4 en placa de LB: Más de 500 colonias.
* Dilución 10-2 en placa de LB-Rifampicina: 2colonias.*
* La dilución 10-1 y el tubo original no dieron lugar a colonias discretas que puedan contarse. Eso es debido a un problema del antibiótico Rifampicina.
• Sólose utilizan las placas marcadas con un asterisco (*) para realizar los cálculos.
• Primero se calculan los títulos de viables y de mutantes, con la siguiente ecuación:
Título(ufcml)=Nº de colonias×1Dilución×10
• Los resultados se muestran a continuación:
* Título de viables en LB: 5.005×108 ufc/ml. Se calcula con los resultados de las 2 placas de LB sembradas a partir de las diluciones...