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Librerías y Proteínas Recombinantes
Carlos Javier Alméciga Díaz Instituto de Errores Innatos del Metabolismo

Genomic cDNA

LIBRERIAS DE ÁCIDOS NUCLÉICOS

2

Qué es una librería de ácidos nucléicos


Colección de clones que contienen fragmentos de ADN insertados en un vector e introducidos en una célula hospedera. ADN = Genoma  Librería Genómica ADN = ADNc  Librería de ADNc Quéno es?









NO es un lugar NO es una base de datos

3

Por qué hacer una librería?


Búsqueda de genes o sus secuencias reguladoras



Análisis de expresión de genes bajo ciertas
condiciones
 

Transcriptómica
Substracción de librerías

 
4

Secuenciación de genomas Estudios evolutivos

LIBRERÍA GENÓMICA





Colección de clones quecontiene TODA la información del GENOMA de un organismo Secuencias codificantes y no codificantes Características:




Fragmentos se deben sobrelapar Generados por un procedimiento independiente secuencia (ideal)


Evita que la librería sea sesgada (que unas secuencias esten y otras no) Evitar recombinanción con el hospedero



Los clones se deben mantener de forma estable


5Fragmentos deben estar sobrelapados?


La biblioteca genómica tiene diferentes copias del mismo fragmento
Cada fragmento queda en un CLON diferente

6

Cómo se hace una librería genómica?

Fragmentar ADN

7

Generando los fragmentos de ADN genómico


Tener en cuenta el tamaño mínimo y máximo del vector que se va a emplear.
Vector Plásmido Fago Cósmido BACs YACs Mínimo (kb) 3 930 100 250 Máximo (kb) 10 23 42 500 1000

8

Generando los fragmentos de ADN genómico - Cómo generar los fragmentos?


Mecánico
  

Fragmentación al azar del ADN mediante sonicación o forzándolo a través de una aguja No se producen fragmentos con extremos terminales cohesivos Se requiere procesamiento posterior para generar extremos cohesivos Uso de enzima de restricción  No esindependiente de secuencia Digestión completa Digestión parcial



Digestión enzimática
  
9

Generando los fragmentos de ADN genómico - Cómo generar los fragmentos?


Digestión completa
  

Enzima de restricción corta en todos los sitios de restricción posibles. Fragmentos pequeños que no se sobrelapan Genes con dos o más sitios de restricción no se pueden obtener completos10

Generando los fragmentos de ADN genómico - Cómo generar los fragmentos?


Digestión parcial
   

Corte menos frecuente en los sitios de reconocimiento de la enzima Se limita la concentración y el tiempo de reacción Fragmentos de diferentes tamaños que se sobrelapan Posibilidad de obtener genes/regiones completas

11

Cómo se hace una librería genómica?

Fragmentar ADN12

Cuantos clones necesito?


Factores




Tamaño del genoma El tipo de vector (tamaño máximo de inserto)
Genoma Tamaño (kb) Número de clones requeridos Plásmido (10 kb) Fago (20 kb) Cósmido (45 kb)

E. coli
S. cerevisiae H. sapiens

4.000
14.000 3.000.000

1200
4.200 900.000

600
2.100 450.000

270
930 200.000

13

Cuantos clones necesito?


Probabilidad deque una secuencia sea encontrada en una librería
Probabilidad deseada de que una secuencia se encuentre en la librería 0,95 0,99

Mínimo número de clones requeridos para encontrar una secuencia deseada

ln 1 − �� �� = �� ln⁡ 1 − ) ( ��
Tamaño del genoma
14

4n
Tamaño promedio de los fragmentos n = tamaño sitio reconocimiento enzima EcoRI (6)= 4096 pb CfoI (4)= 256 pb

LIBRERÍA DE ADNc

Colección de clones que contiene la información de los genes que se estaban expresando en un determinado momento.

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Producción de ADNc
Purificación e integridad mRNA Cebador Retrotranscripción Híbrido DNA-RNA RNasaH
Corte el mNA generando fragmentos Sintetiza 2da cadena usando los fragmentos como cebadores

DNA pol I
DNA ligasa

ADNc de dobe cadena
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Producción de...