Obtención de peroxidasa la peroxidasa lactica

“LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA”

Carrera: Biotecnología.

Asignatura: Tecnología Enzimática.

Practica: N°4 “Propiedades generales y estabilidad de la peroxidasa láctea”
Elaboraron:
1. Esthela Berenice Aguilar Ochoa
2. Iris Noema Montes de Oca Rosales
3. Zaida Nohema Navarro Reynoso
4. Eduardo Sharini Muñoz Equihua
5. Gustavo Pineda Manríquez

Profesor: M.C. DavidGarcía Hernández





OBJETIVO
* El alumno será capaz de determinar las propiedades y la estabilidad con la que cuenta la peroxidasa láctea.
* Se observara el efecto que tiene la temperatura y el pH sobre la actividad de la peroxidasa.

INTRODUCCIÓN
Las enzimas presentes en la leche tienen origen en la ubre de la vaca y en las bacterias.Las primeras se consideran como componentes normales de la leche, son denominadas enzimas originales. Las otras, llamadas enzimas bacterianas, varían en tipo y abundancia según la naturaleza y tamaño de la población bacteriana. Algunas de estas enzimas de la leche se utilizan en controles de calidad. Entre las más importantes están la peroxidasa, catalasa, fosfatasa y lipasa.
La leche se componeprincipalmente de agua en un 80%, proteínas, lactosa, enzimas, grasas, vitaminas, minerales y sales minerales.
Las proteínas son: caseína, globulina y albúmina.
La lactosa que es un azúcar compuesto de glucosa y galactosa.
Las grasas son muy variables dependiendo el tipo de leche.
Entre las vitaminas que encontramos en la leche están: vitamina A, vitamina D, vitamina B1 y vitamina B2.
Losminerales son: calcio, sodio, potasio, magnesio y hierro.
Las sales minerales son: nitratos, sulfatos, carbonatos y fosfatos.
El sabor dulce de la leche proviene de la lactosa y su aroma proviene de la grasa. Su color proviene de la grasa y de la caseína.
La peroxidasa transfiere oxigeno del peróxido de hidrogeno hacia las sustancias oxidables. Esta enzima es inactivada si la leche se calienta a80°c durante unos pocos segundos, circunstancia que puede ser utilizada para demostrar la presencia o ausencia de peroxidasa en la leche y, por lo tanto, para comprobar si la temperatura de pasteurización ha superado o no esos 80°C. Esta prueba se denomina test de la peroxidasa de Storch.
MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPO.
*
* Tubos eppendorf.
* Micropipeta.
* Espátula.
* Tubosde ensayo.
* Probeta.
* Bulbos para pipeta.
* Perillas.
* Gradilla de aluminio.
* Vasos de precipitado.
* Puntas.
* Pipetas Pasteur.
* K2HPO4
* KH2PO4
* H2O2
* (NH4)2 SO4
* H2SO4
* Guayacol
* Balanza analítica
* Centrifuga
* Buffer de fosfato 50mM pH7

METODOLOGÍA
A) Inactivación de la peroxidasa y ensayos cualitativos.
Efectodel calor y los pH extremos sobre la actividad peroxidasa .Adicione 3 ml. de leche en un tubo de ensayo y póngalo a 100 °C/10min. Numere 5 tubos de ensayo y adicione los reactivos en el orden y cantidad (expresada en ml.) establecidos en el cuadro 1. Agite todos los tubos antes y después de poner la leche y observe el color desarrollado en cada tubo a lo largo de unos 10 minutos.
Cuadro No.1efecto del calor y los pH extremos sobre la actividad peroxidasa.
No. Tubo | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
Buffer fosfato | 3 | 2 | 2 | - | - |
H2SO4 al 0.25 | - | - | - | 2 | - |
NaOH al 0.2 | - | - | - | - | 2 |
H2O2 40Mm | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
Guayacol 40 mM | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
Leche fresca | - | 1 | - | 1 | 1 |
Leche hervida | - | - | 1 | - | - |
Efecto de la concentración de lossustratos. Marcar 8 tubos de ensayo a los que debe adicionar los reactivos indicados en el cuadro 2.
No. Tubo | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
Buffer fosfato | 2.8 | 2.5 | 2 | - | 2 | 2.5 | 1.5 | - |
H2O2 40 mM | 0.2 | 0.5 | 1 | 3 | - | 1 | 1 | 1 |
H2O2 400 mM | - | - | - | - | 1 | - | - | - |
Guayacol 40 mM | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0.5 | 1.5 | 3 |
Para iniciar las reacciones, añada...