Optimización de la amplificación de doce exones del gen distrofina asociados a distrofias musculares mediante pcr múltiplex.

UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA
Facultad de Ciencias y Humanidades

Optimización de la amplificación de doce exones del gen distrofina asociados a distrofias musculares mediante PCR múltiplex.

Marco David García King

Guatemala 2007

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Optimización de la amplificación de doce exones del gen distrofina asociados a distrofias musculares mediante PCR múltiplex.

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UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA
Facultad de Ciencias y Humanidades

Optimización de la amplificación de doce exones del gen distrofina asociados a distrofias musculares mediante PCR múltiplex.

Trabajo de investigación presentado por Marco David García King para optar al grado académico de Licenciado en Bioquímica y Microbiología

Guatemala 2007
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Vo.Bo. AsesorPrincipal

______________________________ Lda. Elena Dardón

Tribunal

_____________________________ Lda. Elena Dardón

_____________________________ Dr. Gabriel Silva Arévalo

_____________________________ Dra. Pamela Pennington

Fecha de aprobación: Guatemala 5 de diciembre de 2007

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PREFACIO
La idea de esta investigación nació como parte del proyecto “Detección dedeleciones exonales asociadas a las distrofias musculares de Duchenne y de Becker en Guatemala, mediante la reacción en cadena de la polimerasa en múltiplex”, el cual es auspiciado por FODECYT, las Obras Sociales del Santo Hermano Pedro y la Fundación Aldo Castañeda y está a cargo del Dr. Gabriel de Jesús Silva Arévalo. Como la primera etapa de la realización de este proyecto surgió la necesidad deestandarizar el método para la amplificación de exones del gen distrofina mediante reacciones de PCR multiplex, y a partir de ahí realizar la detección de deleciones en estos exones. Así surgió el apoyo para la realización de este trabajo, el cual se pudo llevar a cabo gracias a la colaboración de muchas personas. Primeramente agradezco a Dios y a la virgen María por acompañarme fielmente en cada etapade mi vida y haberme sostenido en los buenos y malos momentos. Agradezco a mis padres por su gran dedicación hacia sus hijos, su amor y sus buenas enseñanzas y ejemplos. A mis hermanas y demás familia por siempre estar apoyándome a lo largo de cualquier empresa iniciada. Agradezco a mis asesores, el Dr. Gabriel Silva y la Lda. Elena Dardón por darme la oportunidad de realizar este estudio, por sucolaboración a lo largo del proceso de investigación, sus correcciones y sus valiosas enseñanzas; al Dr. Alberto García y la señora Norma del laboratorio de biología molecular de la Universidad de San Carlos por su colaboración para poder completar los análisis de mi estudio. Agradezco al Dr. Héctor Aguilar y la Dra. Pamela Pennington por su apoyo y colaboración durante toda mi carrera. Finalmenteagradezco a mis amigos y compañeros de trabajo por su invaluable ayuda y enseñanzas en el laboratorio y en la vida, y a todos los que contribuyeron a la realización de este trabajo.

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ÍNDICE

PREFACIO LISTA DE CUADROS LISTA DE GRÀFICOS RESUMEN

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Capítulos I. II. INTRODUCCIÒN ANTECEDENTES A. Distrofias musculares de Duchenne y Becker B. Fisiología del músculo C.Gen distrofina D. Diagnósticos utilizados 1. Clínicos 2. Laboratorio clínico 3. Inmunohistoquímicos 4. Moleculares E. Distrofias musculares de Duchenne y Becker en Guatemala F. Tratamientos III. IV. JUSTIFICACIÓN OBJETIVOS A. Objetivo general B. Objetivos específicos V. MATERIALES Y MÉTODOS A. Recolección de muestras B. Extracción de ADN C. Cuantificación de ADN 1 2 2 3 7 10 10 11 13 14 16 17 20 2121 21 22 22 22 23

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D. Estandarización de la PCR E. Visualización de productos de amplificación VI. DISEÑO EXPERIMENTAL A. Unidad experimental B. Tamaño de muestra C. Análisis estadístico VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN A. Extracción y cuantificación de ADN B. PCR heptuplex, cuadruplex y quintuplex C. PCR duplex y triplex D. Efecto de componentes en la mezcla de reacción 1. 2. 3....