PIRIDOXINA

DETERMINACIÓN DE VITAMINA B6 POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN EN ALGAS CON UNA RICA FUENTE DE VITAMINAS DEL COMPLEJO B
MARCO TEORICO
La Association of Official Analytical Chemist ha recomendado la determinación de vitaminas del complejo B mediante métodos microbiológicos, espectrofotométricos y fluorométricos. Los detectores flluorométricos y espectrofotométricos acoplados a HPLChan sido empleados para el análisis de las vitaminas B1, B2, B6 y la nicotinamida tanto en preparaciones farmacéuticas como en fuentes naturales; la cromatografía de fase reversa ha sido muy utilizada en el estudio de estos compuestos. 1
Para esta determinación, se emplea un sistema HPLC formado por una columna de octadecilsilano y fases móviles de metanol - agua - ácido fosfórico 0.1 mol/L(30:69.5:0.5) para las vitaminas del complejo B, empleando hexanosulfonato sódico 5 mM. Las velocidad de flujo es 0.8 mL/min. La determinación se realiza a 270 nm.
Consideraciones para la evaluación de las características de la separación cromatográfica:
Considerando las características complejas de la muestra en estudio, evaluar los diferentes parámetros cromatográficos ya que los sistemas de fase móvilempleados son usuales en el análisis de preparados farmacéuticos, pero no por eso aplicables al tipo de matriz evaluada en nuestro caso. Considerar los parámetros de factor de capacidad (K), el número y altura del plato teórico (N,H), el factor de selectividad (α) y el factor de resolución (Rs).
Para la altura y el número del plato teórico no existe una exigencia reportada, esto indica unaeficiencia conjunta de todo el sistema cromatográfico. El factor de capacidad es un indicador de la interacción de las vitaminas con la fase estacionaria (Tabla 1). Un ejemplo de estos parámetros es el realizado con la especie Arthrospira maxima en donde todos los casos, los valores de k están entre 1-20 que es el rango establecido para muestras complejas.3



En cuanto a la separación y posiblesuperposición de bandas, evalúar los valores del factor de separación y resolución. Para ello se debe determinar la selectividad entre cada vitamina y la señal consecutiva, para obtener en ambos casos valores superiores a uno por lo que puede afirmarse que no hay ningún caso de solapamiento entre las respuestas cromatográficas.
FUNDAMENTO
Técnica que se basa en la separación de dos o más analitos de unamuestra (vitamina del complejo B), mediante la utilización de dos fases, una móvil y una estacionaria, con el agregado de una optimización en los resultados debido la elevación de la presión a la que se somete la corrida cromatografía y la fase estacionaria como componente activo complementando la fase móvil liquida referencial. La HPLC de fase reversa (RP-HPLC) empleada consistirá en una faseestacionaria apolar y una fase móvil de polaridad moderada.2
Reactivos:
Los reactivos empleados son: ácido ortofosfórico, metanol grado HPLC, hexanosulfonato de sodio y cianuro de sodio. Agua purificada en un sistema Milli-Q; ácido clorhídrico. Se emplea papaina y diastasa para fines bioquímicos.
Sistema cromatográfico:
El sistema HPLC consiste en bombas marca Pharmacia LKB, modelo 2248 (Uppsala,Sweden), inyector manual Rheodyne equipado con reguladores de volumen de 20 y 100 µL, columna Spherisorb ODS-2 (250 X 4.6 mm I.D., 5 µm), así como un detector diodo array marca Pharmacia LKB-Bromma, modelo 2140 (Uppsala, Suecia) programado a una longitud de onda de 270 nm para las vitaminas. El sistema cromatográfico es controlado mediante el sistema HPLC manager version 3.01 de Pharmacia LKB,Biotecnology AB (Uppsala, Suecia). La integración de los picos se realiza por la versión 5.0 del programa Nelson.
Fase móvil para tiamina, riboflavina, piridoxina, ácido nicotínico, nicotinamida: metanol - agua - ácido fosfórico 0.1 mol/L (30:69.5:0.5) 5 mM en hexanosulfonato de sodio. Flujo, 0.8 mL/min.
ESTRUCTURAS QUIMICAS

METODO DE ANALISIS
Preparación de las muestras:
Los patrones de tiamina,...