Practicas t.e. bioquimica u.s.

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PRáCTICAS
T.E. BIOQUÍMICA

MÓDULO 1

Ignacio Jose Mosquera Amor

DESARROLLO

El objetivo de esta práctica consiste en la purificación y análisis en todo lo posible de una determinada proteína: la enzima glutamina sintetasa (GS), la cual cataliza la síntesis de glutamina a partir del amonio y glutamato, catalizando así la asimilación de amonio en determinadas bacterias. Ademas de esto,también cataliza una reacción no fisiológica, en la que la glutamina con NH2OH reacciona para formar γ-glutamil hidroxamato y NH3.

ADP, Pi -cetoglutarato

ATP transaminasas
+2e-

NH4+Glutamina Glutamato + Glutamato

GSGOGAT

ADP, Pi ó AsO4=

L-Gln + NH2OH γ-glutamil hidroxamato + NH3
Mn++

Durante estas prácticas realizaremos una cromatografía en DEAE-CELULOSA,para poder distribuir las proteínas en determinadas fracciones separadas por su fuerza iónica y su carga; mediremos la actividad transferasa de la GS, estudiaremos que proteínas se depositarán en esas fracciones y por último estimaremos el peso molecular mediante una electroforesis de la GS y calcularemos parámetros cinéticos de esta como Km y Vmax.

Esta enzima proviene de una cianobacteria,Synechcystis sp PCC 6803 de la cual conocemos su secuencia genomica por completo, por lo que podemos aislar el gen que codifica para dicha proteína. Como necesitamos mucha cantidad de enzima, lo que hacemos con el gen es amplificarlo mediante PCR, se introduciría en un vector de clonación (plásmido) y este a su vez se introduciría en E. Coli para su cultivo, en el cual habría una sobreexpresión de laproteína y su purificación será mas fácil. Una vez que el cultivo madura y produce la proteína, rompemos las células por zonificación y liberamos todo su contenido. Centrifugamos el contenido y de aquí separamos posteriormente la fracción soluble de la insoluble. Recogemos el sobrenadante (la proteína se encuentra en esta parte ya que sabemos que es una enzima soluble, si no supieramos nada de laproteína a estudiar deberíamos analizar las dos fracciones) y este sobrenadante nos servirá como material de partida para la práctica.

DÍA 1- PURIFICACIÓN DE LA GS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA EN DEAE-CELULOSA

El primer paso que debemos llevar a cabo es la separación y purificación de la proteína estudiada.
Partimos de unas pequeñas alícuotas de 1 mL del extracto que contiene la GS y demásproteínas solubles de E. Coli.

La GS es una proteína con un punto isoeléctrico (punto en el cual una proteína no tiene carga) bajo. Al tener un punto isoeléctrico tan bajo, sabemos que a pH 7 tiene grandes cargas negativas, y esto nos servirá para descartar al resto de proteínas con cargas positivas y neutras. Para la separación de proteínas con cargas negativas haremos una cromatografía en unacolumna con un relleno cargado positivamente (con DEAE-celulosa). Se trata de una cromatografía de intercambio iónico en las que haremos pasar las proteínas por la columna, que es una matriz cargada positivamente. Al pasar el extracto se producirán interacciones y las cargas negativas se quedaran pegadas a la columna y el resto saldrán. Así ya conseguimos separar las proteínas cargadaspositivamente y neutras (que ya han salido de la columna), de las negativas (que se quedan pegadas mediante una determinada fuerza iónica). Ahora, para poder separarlas y sacarlas de la columna, añadimos KCl, que compite con la proteína por la unión a la matriz, por lo que la desplazará. Al ir añadiendo el KCl en a diferentes concentraciones, conseguimos sacar las proteínas en orden creciente a su fuerzaiónica. Ademas, utilizaremos para mantener el pH un tampón HEPES 1M pH7. (Las disoluciones de KCl se preparan con HEPES 50 mM porque que si no cambiaría el pH en estas concentraciones, lo cual no nos interesa).

Preparación de reactivos que necesitamos:

1 → 50 mL de HEPES 50mM pH 7.0
2 → 10 mL de una solución 50 mM KCl, HEPES 50 mM pH 7
3 → 10 mL de una solución 100 mM KCl, HEPES 50 mM pH 7...
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