Proyecto

MATERIAL Y MÉTODOS

Extracción de proteínas y clorofilas. Se parte de muestras triplicadas de 10mg de material vegetal liofilizado en polvo.Previamente a la extracción de proteínas es necesario separar las clorofilas. Se añade a cada réplica 1,5mL acetona 80% en frío (4ºC) y se centrifugan 5 min. a10000g. El sobrenadante (acetona-clorofila) se decanta. Repetid el proceso las veces necesarias (al menos 3) hasta que el pellet (proteína) pierda lacoloración verde. Juntad los sobrenadantes (acetona-clorofila) obtenidos. Para extraer las proteínas, se resuspende el pellet en 3mL NaOH 0.1M, conteniendo 1%(p/v) de sodio dodecilsulfato. Se hierven 10min y centrifugan 5min a 10000g, decantando el sobrenadante (proteína). Finalmente se reextrae de nuevo y sejuntan los sobrenadantes.

Extracción de azúcares reductores. Se parte de muestras triplicadas de 20mg de tejido liofilizado. Se mezcla cada replica con4mL metanol 80%. Se calientan 10min a 80ºC y se agitan durante 3min. Se filtra en algodón, conservando el filtrado (azúcares reductores)

Cuantificaciónde proteínas. Método de Bradford. ( hemos diluido la muestra 1:200


Cuantificación de azúcares reductores. Diluir cada muestra 1:5 (0,5ml de muestraoriginal, 2,5 de metanol). Mezclar 1ml de muestra diluida con 1ml de 2-cyanoacetamida 1% y 2ml de tampón borato 0,1M (pH 9,0). Medir absorbancia a 276nm. Elblanco constará de 1ml de metanol, 1ml de 2-cyanoacetamida 1% y 2ml de tampón borato 0,1M (pH 9,0), y también se calentará a 80ºC durante 10min.