Purificación y caracterización de la peroxidasa de la pared celular de la vaina de la vainilla

PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA PEROXIDASA DE LA PARED CELULAR DE LA VAINA DE LA VAINILLA
La peroxidasa es una enzima ampliamente distribuida en la naturaleza, está cataliza la oxidación de ciertos compuestos dadores de hidrógeno, como fenoles (guayacol, pirogalol) y aminas aromáticas (o-fenilendiamina) por medio de peróxidos (H2O2), como agente oxidante (Kay,Leland, y Jow, 1967). Esto esuna reacción cíclica de tres pasos en la que la enzima peroxidasa se oxida por el H2O2 y después se reduce por dos transferencias secuenciales de un electrón por la reducción del sustrato, que comúnmente es una molécula de un derivado fenolico (Castillo et al., 2002).

El origen vegetal de la peroxidasa existe en forma tanto soluble como en la pared celular, pero su función en la pared celularno es totalmente conocida (Thongsook y Barrett, 2005). Estudios han demostrado que la peroxidasa está implicada en la regulación de hormonas de la planta, mecanismos la defensa (Brownleader, Ahmed, Trevan, Chaplin, y Prakash, 1995), regulación del crecimiento vegetal (Hasan, Rasheedi,Y Khatun, 2003) y en la biosíntesis de la lignina. Esta enzima se ha aislado y caracterizado de una gran cantidadde fuentes, como, la hoja de la palma (Deepa y Arumughan, 2002), tubérculos de la papa dulce (Castillo et al., 2002), del brócoli (Thongsook y Barrett, 2005) y tomate (Brownleader et al., 1995). De igual forma la peroxidasa es de gran interés y ha sido ampliamente utilizado como un componente importante del ELISA y kits de inmunoensayo (Castillo et al., 2002; Deepa y Arumughan,2002).

Unaespecie vegetal donde la peroxidasa existe en la pared celular es en la vainilla. La vainilla es una orquídea tropical pero la especie Vainilla planifolia de esta familia es la más cultivada y valorada por sus cualidades saborizantes y por lo tanto es ampliamente utilizada por sus usos culinarios (Ramachandra Y Ravishankar, 2000). Dentro de los estadios de maduración de la vainilla, el proceso llamado“de curado” donde las vainas verdes maduras de vainilla (insípidas) desarrollan su sabor característico, como resultado de reacciones enzimáticas inducidas por acción de la peroxidasa. El resultado principal de estas reacciones enzimáticas es el cambio de color de vainas verdes a café y principalmente el desarrollo de sabor debido la oxidación de los compuestos saborizantes que son fácilmenteoxidables presentes en las vainas curadas (Podstolski et al., 2002). Existe muchos factores determinantes para que la oxidación se lleve a cabo en la pared celular de la vaina de vainilla pero el factor determinante es la presencia de H2O2, como agente oxidante.
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Vainilla Planifolia Vaina Verde de VainillaVaina curada de Vainilla

OBJETIVO

• Obtención, purificación y caracterización de la enzima peroxidasa de la vaina de Vainilla Planifolia.

• Obtención, purificación, titulación e inmunodetección de anticuerpos anti-peroxidasa de Vainilla planifolia.

• Proponer una posible utilidad de los anticuerpos anti-peroxidasa.

METODOLOGÍA

Purificación de la peroxidasa

✓ Materialvegetal

• Vainas de Vainilla (V. planifolia) con ápices amarillos.

✓ Métodos

1. Preparación del extracto crudo de la peroxidasa

Las vainas se lavan con agua destilada, y se cortan en trozos de 1 cm y se liofilizan.

25 gramos de muestra se pulverizan en un molino y el polvo se transfiere a un homogeneizador (Ika Labortechnik T 25) en presencia de 200 ml de buffer bis-Tris–propano 150mM (BTP) pH 8.0 con 2mM de ácido etilendiamino-tetraacético (EDTA), 3 mM de DL-ditiotreitol (DTT) y 1.25 g de polivinilpolipirrolidona (PVPP). El homogeneizado se filtra a través de un filtro de papel Whatman No.1 y el filtrado se lava dos veces con 100 ml de buffer BTP 150 mM (pH 8.0) (Dignum, Kerler, y Verpoorte, 2001). El filtrado se centrifuga a 37 500r durante 20 minutos a 4 °C. El...