Revisiòn de mètodos espectroscòpicos y elaboraciòn de curva estàndar de proteìnas

REVISIÒN DE MÈTODOS ESPECTROSCÒPICOS Y ELABORACIÒN DE CURVA ESTÀNDAR DE PROTEÌNAS


INTRODUCCION
La espectrofotometría se refiere a la medida de cantidades relativas de luz absorbida por una muestra, en función de la longitud de onda. Cada componente de la solución tiene su patrón de absorción de luz característico. Comparando la longitud de onda y la intensidad del máximo de absorción de luzde una muestra versus soluciones estándar, es posible determinar la identidad y la concentración de componentes disueltos en la muestra (solución problema).Las ventajas de la espectrofotometría sobre otros métodos analíticos de laboratorio son varias: es rápida, precisa, versátil, fácil de usar y eficiente en costo. Los espectrofotómetros se han mejorado en precisión y versatilidad en los últimosaños con los avances de tecnología, y hoy se consideran indispensables en un laboratorio de química analítica. En general, los espectrómetros miden en % de transmitancia (T) y absorbancia (A). El porciento de transmitancia se refiere a la cantidad de radiacion que pasa a través de la muestra y alcanza el detector. Una solución límpida, no absorbente, mostrara una lectura de 100% de transmitanciaen un espectrofotómetro calibrado. Las unidades de absorbancia van de 0 a 2.
Método de Lowry:
Es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. A la muestra se añade un reactivo que forma un complejo coloreado con las proteínas, siendo la intensidad de color proporcional a la concentración de proteínas, según la ley de Lambert-Beer .

Este método consta de dos etapas:  1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína tienen un color azul claro. Además, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose los residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reacción. El Cu2+ semantiene en solución alcalina en forma de su complejo con tartrato.

  2)   La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayoría de las proteínas, actuando el cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que alser reducido por los grupos fenolicos da lugar a un complejo de color azul intenso.

OBJETIVOS

- Aplicar un método espectroscópico para medir la concentración de una proteína
- Construir cuervas de calibración y entender su importancia
- Realizar el uso correcto de micro pipetas y espectrofotómetros
- Mediante un método colorimétrico como el de Lowry valorarcuantitativamente la cantidad de proteína en dos muestras problema.

HIPOTESIS
Debido a que iremos aumentando el volumen en cada tubo, con albumina de suero bovino (BSA), la absorbancia en cada tubo irá incrementando debido a la reacción del reactivo de de Folin-Ciocalteau con los residuos de tirosina (Tyr) presentes en la mayoría de las proteínas encontradas en BSA. Esto se verá reflejado en el aumento de latonalidad de los tubos.
Mediante la ecuación que describe la curva de calibración podremos obtener la cantidad de proteína en las muestras problemas 9 y 10 con el simple hecho de conocer la absorbancia en cada muestra.

RESUMEN
Primero hay que numerar los tubos del 1-10 y adicionar los reactivos de acuerdo a la tabla 1.2 que se encuentra en el protocolo de prácticas de bioquímicaexperimental. Hay que mesclar con el vortex después de agregar cada solución al tubo. Posteriormente con el espectrofotometro medir las absorbancias de cada tubo, a una longitud de onda de 750nm. Calcular la concentración de proteína de las muestras usando la ecuación de Lambert y Beer.luego construir las grafica de absorbancia vs concentración de proteína. Y con la ecuación obtenida al realizar la...