Secuenciación Adn

Secuenciación automática de ADN.
Estrategias de secuenciación
Curso de doctorado: técnicas
instrumentales.
2008
Manuel Sánchez Hernández
Servicio de Secuenciación de ADN, Universidad de Salamanca.

SECUENCIACION DE ADN
Métodos clásicos de secuenciación
.Método químico de Maxam y Gilbert (1977)
.Método enzimático de Sanger (1977)
Secuenciación automática
.Secuenciación con cebadoresfluorescentes
.Secuenciación con terminadores fluorescentes
Secuenciadores automáticos
.Secuenciadores en geles desnaturalizantes
.Secuenciadores capilares
.Secuenciación masiva, nanosecuenciación……

METODO QUIMICO DE MAXAM Y GILBERT

Metodo de Sanger (1977)
ssDNA

dsDNA

Desnaturalizar
Hibridación con el oligo
5‘

3‘

DNA Polimerasa y dNTPs (uno al menos marcado )
3‘

5‘AC G T
5‘
Cuatro reacciones de parada
con un desoxinucleótido
cada una
ddA

AA
A

ddC

A

ddT

T

C

C

A

ddG

3‘
Electroforesis

G
C

G

T

5‘

A
G
C
T
A
T
G
A
C
A
C
A

Autorradiografía

Autorradiografia
Leemos unos 300 nucleótidos
Electroforesis corta

SECUENCIACION AUTOMATICA CON FLUOROCROMOS

Secuenciación con terminadoresmarcados

ddNTPs
dNTPs
Taq polimerasa
A
C
G
T
ANILLAMIENTO

EXTENSION

A
A
A
A
A
A
A

C
C
C
C
C
C

C
C
C
C
C

G
GT
GTA
GTAT

ELECTROFORESIS

PRODUCTOS

ANALISIS DE LOS FRAGMENTOS
EN EL SECUENCIADOR

SECUENCIACION AUTOMATICA CON FLUOROCROMOS
Secuenciación con los primer marcados
ddNTP
dNTPs
Taq polimerasa
A
ANILLAMIENTO

EXTENSION

C

A
ACCGTAPRODUCTOS

AC
ACC

G

ELECTROFORESIS

ACCG
ANALISIS EN EL
SECUENCIADOR

T

ACCGT
ACCGTAT

CICLO DE LA REACCION DE SECUENCIACION AUTOMATICA
ANILLAMIENTO
MEZCLA DE
REACCION
ACGT
Enzima, dNTPs

EXTENSION

94°C
96°C

10 sec

50°C

5 sec

60°C

4 min

4°C

A
C
C
TG

3 min

∞

MOLDE
ORIGINAL

25 CICLOS
DESNATURALIZACION

A
A
A
A
A
A
A

CC
C
C
C
C

C
C
C
C
C

PRODUCTOS

G
GT
GTA
GTAT

Secuenciadores automáticos

*Secuenciadores en geles desnaturalizantes de acrilamida-bisacrilamida.
*Secuenciadores capilares.

Gel de acrilamida-bisacrilamida para el 377 DNA sequencer

Preparación de la electroforesis en el 377 DNA sequencer

A: Casette
B: Tapa cubeta superior
C: Barra protectora del laser
D:Cubeta superior
E: Pinzas
F y G: cubeta inferior
H: Dispositivo de carga

ABI PRISM 377 DNA SEQUENCER

3100 Capillary Array

ABI PRISM 3100 GENETIC ANALYZER

ABI PRISM 3100 GENETIC ANALYZER

A

C

G

T

A
C
G
T

Autorradiografía
(300 nt)

Secuenciador
Automático (+700 nt)

VENTAJAS DE LA SECUENCIACION AUTOMATICA

La contaminación que se produce es mucho menorpues no utiliza radiactividad.
Más cómodo, la secuencia la obtenemos directamente en el ordenador, no tenemos
que leer una autorradiografía que puede conducir a cometer errores de lectura.
Mucha más secuencia en cada gel. En la secuenciación automática se leen unos
700-800 nucleótidos por carrera y en cada gel pueden entrar hasta 96 carreras.
En la manual normalmente se colocan 7 carreras yse puden leer alrededor de 300
nucleótidos en cada una. Los secuenciadores capilares pueden llegar a analizar 96
Carreras en menos de dos horas.

Es mucho más rápido que la manual para poder leer grandes fragmentos de ADN.

Es más barato. El inconveniente mayor es la inversión inicial al adquirir el equipo

UTILIDADES DE LA SECUENCIACION AUTOMATICA
Comprobar si una construcción escorrecta. ADN recombinante
Encontrar mutaciones en un fragmento de ADN
Diagnóstico de enfermedades genéticas (gen Ras y cáncer)
Conocer la secuencia de genes. Enviamos las secuencias a las bases de datos
Identificación de especies y control de cruces entre animales (ADN mitocondrial)
Secuenciación completa de genomas. Saccharomyces cerevisiae,
Schizosaccharomyces pombe, Genoma humano......