tecnicas de purificacion y caracterizacion de proteina

TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS

TRABAJO DE BIOQUIMICA

PRESENTADO POR
YUDY LILIANA LOPEZ PULGARIN

PRESENTADO A:
DRA. MARICELA VIOLA RHENALS

UNIVERSIDA DE CARTAGENA
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
PROGRAMA DE QUÍMICA
13 / JUNIO / 2013

TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS

INTRODUCCIÓN
Dado que una célula contiene miles deproteínas distintas, la tarea de separarlas y determinar la
estructura de una sola proteína es en extremo difícil. Hay muchas técnicas para purificar y
caracterizar proteínas, que van desde estrategias para determinar características físicas como el
peso molecular, el punto isoeléctrico y el número de subunidades, hasta descubrir el número y el
tipo de sus aminoácidos constituyentes ydeterminar su secuencia completa. Una vez que una
proteína se ha degradado a sus aminoácidos, se les puede identificar por cromatografía según su
carga y polaridad. Se puede averiguar que aminoácidos están en los extremos de una proteína
marcándolos químicamente. La cadena entera se puede degradar por hendimiento específico para
dar fragmentos peptídicos relacionados. Luego, cada péptido se puededegradar aminoácido por
aminoácido para descubrir su secuencia. En el paso final de la determinación de la estructura, la
proteína completa se somete a un análisis por difracción de rayos X para determinar su
conformación tridimensional. Sin embargo, antes es necesario purificar la proteína empleando
técnicas como cromatografía de columna y electroforesis y luego cristalizarla1.

PURIFICACIÓN DEPROTEÍNAS
En una sola célula hay muchas proteínas distintas. Para estudiarla detalladamente las propiedades
de cualquier proteína es preciso contar con una muestra homogénea que solo contenga moléculas
de un tipo. La separación y aislamiento (purificación) de las proteínas constituye un primer paso
indispensable para experimentos ulteriores. En general, las técnicas de separación se concentranen el tamaño, la carga y la polaridad, que es donde residen las diferencias entre moléculas. Se
aplican muchas técnicas para eliminar contaminantes y lograr una muestra pura de la proteína de
interés. Al seguirse los pasos de purificación, se elabora una tabla de recuperación y pureza de la
proteína para juzgar el éxito. 1

AISLAMIENTO DE PROTEÍNAS DE LA CELULAS
Antes de los pasos depurificación propiamente dichos, es preciso extraer las proteínas de las
células y organelos subcelulares. El primer paso se denomina homogeneización e implica la
ruptura de las células. Esto puede efectuarse con diversas técnicas. La más sencilla es moler el
tejido en una licuadora con un amortiguador apropiado. Para las células se rompen y liberan
proteínas solubles. Este proceso también rompemuchos de los organelos subcelulares, como

mitocondrias, peroxisomas y retículo endoplasmatico. Una técnica más suave utiliza un
homogeneizador protter-Elvejhem: un tubo de ensayo con paredes gruesas a través del cual se
hace pasar un embolo muy ajustado. La muestra a homogeneizar se aplasta contra las paredes y

Las células se rompen, aunque los organelos suelen quedarse intactos. Otratécnica, llamada
sonicación, implica el uso de ondas sonoras para romper las células. Las células también pueden
romperse mediante ciclos de congelación y descongelación. Si la proteína de interés está unida
firmemente a una membrana, podría ser necesario agregar detergentes para separar las proteínas

Una vez homogeneizadas las células, se someten a centrifugación diferencial. Cuando la muestrase hace girar a una 500 veces la fuerza d la gravedad (500 x g), se forma una pastilla de células y
núcleos enteros. Si la proteína de interés no está en los núcleos, este sedimento se desecha. El
sobrenadante se puede centrifugar entonces a mayor velocidad, digamos 10.000 x g, para que se
asienten las mitocondrias. Si la proteína de interés es soluble, el sobrenadante de esta operación...