Tecnicas Purificacion Proteinas

Purificación de las proteínas.
Se han purificado varios miles de proteínas en forma activa en base a características como solubilidad (salting out), tamaño (cromatografía por filtración en gel y SDS-PAGE), carga (cromatografía de intercambio de iones) y afinidad específica de unión (cromatografía de afinidad). El mecanismo habitual consiste en que la mezcla de proteínas se somete a diferentesseparaciones, cada una de ellas basada en propiedades diferentes, para obtener la proteína pura. En cada paso de esta purificación, se ensaya la actividad de la proteína deseada y se determina la concentración proteica. Se necesitan cantidades importantes de proteínas puras, del orden de muchos miligramos, para clarificar sus estructuras tridimensionales y sus mecanismos de acción. Por lo tanto, elrendimiento global es un rasgo importante de un esquema de purificación. Se pueden utilizar diversas técnicas. Entre ellas:
1) “Salting out.”
También llamada conocida como precipitación salina.
La mayoría de las proteínas son menos solubles a concentraciones elevadas de sal, lo que se llama al efecto de precipitación salina. Las concentraciones de sal en las que precipita una proteínavarían de una proteína a otra; de aquí que la precipitación salina pueda utilizarse para fraccionar proteínas.
Si se ajusta la concentración de de sal de una disolución que contiene una mezcla de proteínas, justo por debajo del pinto de precipitación de la proteína que se desea purificar, se eliminan muchas de las proteínas no deseadas de la disolución (fig.5-5). Entonces, después de retirar lasproteínas precipitadas mediante filtración o centrifugación, la concentración de sal de la disolución restante se aumenta para hacer precipitar la proteína deseada. Este procedimiento genera una purificación significativa y se concentran grandes cantidades de proteína.
El sulfato de amonio (NH4)2SO4, es el compuesto más usado para la disminución de la solubilidad de las proteínas debido a que suelevada solubilidad (3.9 M en agua a 0ºC) permite la preparación de soluciones con alta fuerza iónica.

CROMATOGRAFÍA
El proceso de cromatografía fue descubierto en 1903 por Mikhail Tswett, quien separó pigmentos vegetales en solución por medio de la utilización de absorbentes sólidos. En la mayoría de los procedimientos cromatográficos modernos, una mezcla de sustancia que se fraccionarán sedisuelve en un líquido (fase móvil) y se filtra a través de una columna que contiene una matriz sólida porosa (la fase estacionaria). A medida que los solutos atraviesan la columna interactúan con la fase estacionaria y retardan su paso. Las fuerzas de retención dependen de las propiedades de cada soluto. Si la columna tiene la longitud necesaria, las sustancias con distintas velocidades de salida seseparan. Los procedimientos cromatográficos que son más útiles en la purificación de proteínas se clasifican de acuerdo con la naturaleza de la interacción entre la proteína y la fase estacionaria.
2) Cromatografía de afinidad.
Una de las características llamativa de muchas proteínas es su capacidad de unirse fuertemente a moléculas específicas, pero de manera no covalente. Esta propiedades la utilizada para ese proceso. (Fig.5-8)
En este proceso, una molécula (un ligando) que se une de manera específica a la proteína de interés se une covalentemente a una matriz inerte. Cuando una solución de proteína impura pasa a través de este material, la proteína deseada se une al ligando inmovilizado, mientras que otras sustancias se lavan de la columna con la solución reguladora. Laproteína deseada puede entonces recuperarse en una forma purificada si se cambian las condiciones de dilución para liberarla de la matriz. La gran ventaja de esta técnica es su capacidad de explotar las propiedades bioquímicas unidas de la proteína deseada en lugar de las pequeñas diferencias en las propiedades fisicoquímicas entre proteínas, utilizadas por otros métodos cromatográficos. En...