transfección: cultivos celulares

22 de Octubre de 2013

U.F.V

TÉCNICAS DE TRANSFECCIÓN DE ÁCIDOS
NUCLÉICOS EN PROCESOS CELULARES

Organismos Modificados Geneticamente
-Cultivos celularesAida Pino, Carlos Sánchez,
Paloma Solá, Cristina Tejedo, Laura Ugalde

Índice
 Fundamento de la Técnica
 Métodos Biológicos
 Transducción: mediante vectores virales
 Bactofección: mediante vectores bacterianos

 MétodosBiológicos
 Transfección Química
Con fosfato cálcico
Con polyplexes y dendrímeros
Con liposomas y lipoplexes
o Transfección en células en suspensión
o Transfección de células adherentes
 Transfección Física

Biolística
Ultrasonidos
Microinyección
Electroporación
Laserfección

 Bibliografía

Fundamento de la Técnica:
La transfección permite el estudio de la regulación y lafunción de un determinado gen,
bien sea mediante silenciamiento, unión a un gen reporter... En este caso se estudiará la técnica
empleando células aisladas en cultivo como sistema receptor.

Métodos Biológicos:
Transducción: mediante vectores virales
La transducción es el uso de virus para transferir un DNA de interés a una línea celular
o célula concreta. Para que esto pueda llevarse a cabo loque nos hace falta es un virus que sea
capaz de infectar a la célula objetivo y que contenga el DNA de interés. Teniendo esto en
cuenta, es muy importante saber elegir el virus concreto para la infección, ya que un requisito
indispensable para la transducción es que el virus pueda reconocer alguno de los receptores de
la membrana de la célula objetivo. Además tenemos que tener en cuenta que enfunción de
nuestros intereses podemos elegir un virus que integre nuestro DNA de interés dentro del
genoma de la célula o bien que lo deje libre.
Los pasos que se llevan a cabo en el método de transducción son los siguientes:
-Generación de virus recombinantes con el DNA de interés mediante clonajes.
-Amplificación de la partícula viral y aislamiento del virus.
-Purificación de laspartículas virales.
-Infección a la línea celular. En este paso, el DNA se insertará o no el en genoma
dependiendo de la partícula viral usada.

Los tipos de vectores virales que se suelen utilizar son:
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Los retrovirus, que insertan el DNA dentro del genoma del huésped, pero que solo
transducen a células en división.
Los adenovirus, que poseen gran eficiencia de transducción y que soncapaces de
insertar grandes fragmentos de DNA. Además no necesita que las células estén en
división para infectarlas. Estos vectores no insertan el DNA en el genoma.
Los herpesvirus, que se utilizan para transducir neuronas y que pueden albergar grandes
fragmentos de DNA. Es necesario quitarle los factores líticos para que no maten a la
célula.
Los virus adenoasociados (parvovirus), querequieren una coinfección con un
adenovirus. Su capacidad para transportar un DNA exógeno es muy pequeña, pero tiene
una alta eficiencia de transducción y pueden infectar a células en división o que no
estén en división. Además, no causan respuesta inmune.

Una de las ventajas de este método es que tiene une eficiencia de transfección muy elevada,
casi del 100%. Además, puedes introducir variosgenes con sus diversos factores de expresión
ya que el tamaño de inserto o plásmidos que permite este método es grande. Otra ventaja es que
según el virus que usemos para transfectar podemos hacer que el inserto transfectado se
introduzca en el genoma de la célula a transfectar o bien podemos hacer que se quede en forma
de plásmido.
Los principales inconvenientes son: lo laborioso deintroducir el DNA en el virus vector, lo
cual se traduce también a un coste elevado; y que al tratarse de un patógeno para la célula,
puede desencadenar una respuesta inmune o anómala en la célula.

Bactofección: mediante vectores bacterianos
Métodos basados en Agrobacterium
Utilizado para la producción de plantas transgénicas, se trata de la infección por
Agrobacterium tumefaciens. Se trata de...