A-lactoalbumina

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PROPUESTA DE TRABAJO EXPERIMENTAL LABORATORIO BIOQUÍMICA QIM-117

PROTEÍNAS, α-LACTOALBÚMINA.

OBJETIVO GENERAL: Aislar y purificar una proteína de la leche.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

1. Aislar y purificar la proteína α-lactoalbúmina de la leche.
2. Cuantificar la proteína α-lactoalbúmina de la leche.

FUNDAMENTOS:

Los métodos de separación de proteínas aprovechan propiedades quevarían de una proteína a otra, entre los que se incluyen el tamaño, la carga y las propiedades de unión.
Para proceder a la purificación, el extracto de donde se obtendrá la proteína se somete a tratamientos que separan las proteínas en diferentes fracciones en virtud de alguna propiedad tal como el tamaño o la carga, un proceso denominación fraccionamiento. Los pasos iniciales de fraccionamiento deuna purificación utilización diferencias en la solubilidad de las proteínas, que es una función compleja del pH, temperatura, concentración de sal y otros factores. La solubilidad de las proteínas disminuye generalmente a concentraciones elevadas de sal, un efecto denominado “salting out”. La adición de algunas sales en cantidades apropiadas puede precipitar selectivamente algunas proteínas,permaneciendo las restantes en solución. El sulfato de amonio es particularmente efectivo y se usa a menudo para conseguir este efecto. Por otra parte, el pH también puede utilizarse efectivamente para la precipitación selectiva de proteínas: un cambio en el pH altera el estado iónico de la proteína, pudiendo dejarla con carga neutra (punto isoeléctrico), lo que genera aglomeración de las proteínas yfinalmente su precipitación(1).

Para cuantificar la α-lactoalbúmina obtenida, se utilizara la capacidad que tiene la materia de absorber la luz, explicada por la ley de Lambert – Beer, la que afirma que la cantidad de luz que atraviesa una muestra disminuye por 3 fenómenos físicos:

1. La cantidad de material de absorción en su trayectoria (concentración).
2. La distancia que la luz debeatravesar pasando por la muestra (distancia de la trayectoria óptica).
3. La probabilidad de que el fotón de una longitud de onda particular sea absorbido por el material (coeficiente de extinción molar).

Esta relación puede ser descrita como:

A = εlc,

A :absorbancia.
ε: coeficiente de extinción molar.
l: longitud que debe atravesar la luz en centímetros.
c: concentración molar de lasolución.

De esta forma, al medir la absorbancia a 595 nm podremos conocer la concentración de la muestra(2).
Para esto, se usará el método de Bradford, el que se basa en la unión de un colorante, Comassie Blue G-250 (también Serva Blue) a las proteínas. El colorante, en solución ácida, existe en dos formas una azul y otra naranja. Las proteínas se unen a la forma azul para formar un complejoproteína-colorante con un coeficiente de extinción mayor que el colorante libre. Este método es sensible (1-15 μg), simple, rápido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinación. Entre las sustancias que interfieren están los detergentes y las soluciones básicas.
Algunas ventajas y/o desventajas del Método:

* La intensidad de absorción depende del contenido de aminoácidos básicosy aromáticos.
* El complejo colorante-proteína tiene un alto coeficiente de extinción lo cual es imprescindible para aumentar la sensibilidad en la medición de proteínas.
* La unión colorante-proteína es un proceso muy rápido (2min) y el complejo permanece estable durante un tiempo relativamente largo, una hora. Haciendo de este un proceso muy rápido, y que no requiere un tiempo críticopara el ensayo.
* Se pueden utilizar un gran número de muestras (muy reproducible) y es adaptable a la automatización.
* Las interferencias o no existen o son mínimas por cationes tanto sodio como potasio y carbohidratos como la sacarosa. Otras sustancias que interfieren en el ensayo son los agentes fuertemente alcalinos (fácilmente solucionable con la utilización de buffers). Los...
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