Electroforesis Y Western Blot

Electroforesis de Proteínas
Western Blot













20 de Abril, 201
I.- Introducción
Se han desarrollado distintas técnicas para poder identificar y caracterizar a diversas proteínas. Estas técnicas pueden tener comoobjetivo identificar el peso molecular, estructura, carga, entre otras propiedades de la proteína. Durante este paso práctico se utilizaron dos métodos para poder realizar el análisis de proteínas. El primero fue una electroforesis, seguido posteriormente de un western blot.
La electroforesis es una técnica que separa a moléculas cargadas las cuales migran por un campo eléctrico. Las moléculasse separan según su peso molecular, carga y forma. (1) Dentro de la electroforesis existen diversos métodos, tales como la Electroforesis Discontinua, la Electroforesis en Gel de Poliacrilamida (PAGE), Electroforesis en Sodium Dodecyl Sulfato-Policarilamida (SDS-PAGE), la Electroforesis en gel de Agarosa, entre otras. En este paso practicó se utilizó la SDS-PAGE.
En la SDS-PAGE, las proteínasson tratadas son un detergente SDS y un agente reductor B-mercaptoetanol. Debido a que la movilidad electroforética es influenciada por el tamaño y carga de las proteínas, en este método se forman cadenas polipeptídicas de una proporción carga/masa constantes, pudiendo así realizar un análisis del peso molecular. (1) Esta técnica también es conocida como electroforesis denaturante, ya que lasproteínas sufren una denaturación por los agentes adicionados. El detergente SDS altera la estructura de la proteína, produciendo polipéptidos lineales cargados negativamente con la molécula SDS. Por otro lado, el agente reductor de puentes disulfuro, B-mercaptoetanol ayuda en la denaturación de las proteínas, ya que rompe los enlaces S-S. El detergente se une a las regiones hidrofóbicas de laproteína denaturada. (1) Cabe destacar que la movilidad electroforética de las proteínas-SDS, es influenciada por el tamaño de la molécula. Moléculas más grandes tendrán una movilidad reducida, y las más pequeñas tendrán mayor movilidad. (1) Por lo tanto, al correr la muestra en el gel de poliacrilamida, se formaran bandas de acuerdo al tamaño (peso molecular).
Para poder identificar una proteínade interés dentro de todas las que se obtuvieron en la electroforesis realizada previamente, se utiliza la técnica de Western Blot, también conocida como Inmuno Blot. Esta técnica utiliza dos anticuerpos, el primero reconoce a la proteína de interés, y el segundo reconoce y se une específicamente al anticuerpo primario. (2)
Las proteínas obtenidas por electroforesis se llevan a una membrana denitrocelulosa, a la cual se le agrega una solución de leche en polvo, para así bloquear los sitios de la membrana que no están unidos a proteínas. Esto permite que los anticuerpos utilizados en Western Blot no se unan a esos sitios. Posteriormente se incuba con el anticuerpo primario, el cual se una a las proteínas específicamente. Luego, la membrana se lava con un detergente no-iónico, el cuálinterviene en las interacciones hidrofóbicas entre el anticuerpo primario y otras proteínas de la membrana que no son de interés. Posteriormente, la membrana es incubada con el anticuerpo secundario (anti-IgG), el cual se une específicamente al anticuerpo primario. Este anticuerpo secundario está unido covalentemente a una enzima marcadora, la cual es responsable de la reacción quimioluminiscente que se usa para detectar a las proteínas. Una vez unido el segundo anticuerpo, se vuelve a lavar con el detergente no-iónico para eliminar posibles uniones del anticuerpo secundario a proteínas de la membrana no deseadas. Finalmente se agrega una solución que contiene un sustrato que reacciona con la enzima del anticuerpo secundario. Esta reacción puede producir un precipitado de color, o un...