Extraccion Dna

UNIDADE 2: PURIFICACIÓN DE DNA DE CÉLULAS VIVAS – CIFP POLITÉCNICO DE SANTIAGO. CURSO 2009/10 

 

PURIFICACIÓN DE DNA DESDE CÉLULAS VIVAS
1. INTRODUCCIÓN
A enxeñería xenética necesitará en diferentes ocasións preparar alomenos 3 distintas clases de DNA. Primeiro o DNA celular total, a miúdo requirido como fonte de material desde o cal obteremos xenes para ser clonados. O DNA celular totalpodemos obtelo desde un cultivo de bacterias, desde unha planta, desde células animais, ou desde calquera outro tipo de organismos que están sendo estudados. O segundo tipo de DNA que soe ser requirido é o DNA plasmídico puro. A preparación de DNA plasmídico desde un cultivo de bacterias seguindo os mesmos pasos básicos como na purificación do DNA celular total, coa diferenza crucial que o DNAplasmídico debe ser separado do DNA cromosómico principal tamén presente na célula. Finalmente o DNA fágico , o cal será necesario si o fago é usado como vehículo de clonación. O DNA fágico está xeralmente preparado desde partículas bacteriófagas máis que desde células infectadas,por tanto non hai problemas de contaminación do DNA bacterial. Sen embargo técnicas especiais son necesarias para eliminara cápsula do fago. Unha excepción e a forma de dobre cadea replicativa do M13 , o cal é preparado desde células de E.coli da mesma forma dun plásmido bacterial.

2. PREPARACIÓN DO DNA CELULAR TOTAL
Para coñecer os fundamentos da preparación do DNA é máis doadamente comprensíbel considerar primeiramente o procedemento de purificación do DNA sinxelo. As modificacións para DNA plasmídico e fágicoas describiremos máis tarde. O procedemento para a preparación do DNA total desde un cultivo de células bacteriais pode ser dividido en catro etapas: ( Figura 3.1 )

1   

UNIDADE 2: PURIFICACIÓN DE DNA DE CÉLULAS VIVAS – CIFP POLITÉCNICO DE SANTIAGO. CURSO 2009/10 

 

FIGURA 3.1

a) Facemos crecer un cultivo de bacterias e concentrámolas. b) Abrímolas células rompéndoas para liberaro seu contido c) Este extracto celular é tratado para eliminar os compoñentes excepto o DNA. d) A solución do DNA que resulta é concentrada.

Crecemento e colleita de cultivos bacteriais
A maioría de bacterias poden ser crecidas sen demasiada dificultades nun medio líquido ( caldo de cultivo). Os medios de cultivo deben producir unha mestura balanceada de nutrientes esenciais a concentraciónsque permitirán as bacterias crecer e dividirse eficazmente. Dous medios de crecemento típicos son detallados na táboa 3.1.

2   

UNIDADE 2: PURIFICACIÓN DE DNA DE CÉLULAS VIVAS – CIFP POLITÉCNICO DE SANTIAGO. CURSO 2009/10 

 

TÁBOA 3.1

M9 é un exemplo dun medio definido no cal coñecemos todos os compoñentes. Este medio contén unha mestura de nutrientes inorgánicos que proveen deelementos esenciais tales como nitróxeno, magnesio e calcio, así como glucosa para suplir o carbono e a enerxía. Na práctica debemos engadir factores de crecemento tales como elementos traza e vitaminas. Precisamente os suplementos que son necesarios depende da especie a estudar. O segundo medio descrito na táboa é totalmente diferente. Luria – Bertani (LB) é un medio complexo ou indefinido, significaque os compoñentes e a cantidade dos mesmos é descoñecida. Isto ocorre porque dous dos ingredientes, triptona e extracto de fermentos, son mesturas complexas de composición química descoñecida. A triptona suple de aminoácidos e pequenos péptidos, mentres que o extracto de fermentos ( unha preparación seca de células de fermentos parcialmente dixeridas), producen o nitróxeno requirido, así comoazucres e nutrientes inorgánicos e orgánicos. Os medios complexos como o LB non necesita tantos suplementos para o crecemento da maioría das especies bacterianas. Medios definidos deben ser usados cando o cultivo bacterial ten que medrar en condicións controladas.Sen embargo non é necesarios cando é para un simple crecemento como fonte de DNA, e baixo esas circunstancias un medio complexo é...