Actividad Enzim Tica De La

Actividad enzimática de la amilasa Agustín Garrido agugarrido@hotmail.com Introducción : La α-amilasa es una enzima proteica que se encuentra en la saliva humana y cataliza la degradación del almidón, que es un polisacárido de reserva vegetal. El almidón está formado por dos tipos de moléculas: la amilosa y la amilopectina, ambos polisacáridos de glucosa. La amilosa se conforma por cadenaslineales de glucosas unidas por enlaces α- C1-C4, mientras que la amilopectina tiene, además de estos últimos enlaces, uniones C1 con C6, formando cadenas ramificadas. La α-amilasa rompe uniones C1-C4, tanto en la amilasa como en la amilopectina, dejando dextrinas lineales y ramificadas (oligosacáridos) como productos. Para medir la actividad enzimática de la α-amilasa, se utilizará un testcolorimétrico que detecta el almidón. Para ello se contará con una solución de iodo/ioduro de potasio (I 2 /IK), ya que el almidón en presencia de esta solución adquiere una coloración azulada característica. Esto tiene una explicación física: el iodo se coloca en el interior de la hélice que forma la amilosa (en las regiones hidrofóbicas), formando un complejo de color azul. Cuando la α-amilasa actúa,degrada la amilosa, se desintegra la hélice y por tanto en presencia de I 2 /IK ya no dará una coloración azul. Por lo tanto, en este TP mediremos la desaparición de sustrato (evidenciada por el test colorimétrico) para determinar la actividad de la enzima. Además, analizaremos cómo afectan las distintas condiciones en que actúa la enzima (pH, temperatura, concentración de NaCl), así como los efectosque pueden causar diferentes pretratamientos (proteinasa, calor). La dilución óptima nos indicará cuánto debemos diluir la saliva para que se logre el efecto acromático dentro del rango propuesto (2-8 minutos). Metodología : Se partió de una muestra de saliva de un integrante del grupo y se la recogió en un vaso de precipitado que se colocó en un recipiente con hielo para reducir la energíacinética (para disminuir el contacto de las moléculas, reduciendo las interacciones químicas que se pudieran producir) de compuestos presentes en la saliva que puedan afectar el funcionamiento de la proteína. A partir de la muestra, se tomó una alícuota para impregnar un papel indicador de pH sobre un papel blanco. El pH obtenido fue entre 7-8. Desde aquí, el trabajo se dividió en dos partes: una paradeterminar la dilución óptima y el tiempo de referencia y la otra, modificando una de las condiciones experimentales. Parte 1: Se tomó 1 ml de saliva de la muestra del vaso de precipitados y se lo diluyó con 9 ml de agua destilada en un tubo de ensayo, obteniendo una dilución 1/10. Luego se mezcló por inversión, evitando que la solución adquiera energía cinética y se produzca la desnaturalización dela enzima de nuestro interés; y se lo colocó en hielo, por la misma razón antes expuesta. Se preparó una gradilla con 15 tubos, conteniendo cada uno una solución (de coloración amarilla) de 5 ml de agua de la canilla y una gota de I 2 /IK 0,01M, que se mezcló por agitación para obtener una solución homogénea. Luego, se nos entregó una solución de almidón 1% p/v a baño térmico a 37° C (para queconforme una solución homogénea). Se extrajeron 6 gotas con pipeta Pasteur de la solución de almidón y se la volcó en un tubo 0 de la gradilla, mezclándolo por inversión y obteniendo un color azul característico del complejo Iodo-almidón. Prontamente, se colocó en el tubo con almidón 1 ml de la dilución 1/10 de la saliva (que contiene a amilasa) y en ese instante se comenzó a cronometrar. A los 30segundos, se retiraron 6 gotas de esta solución a 37° C donde debía ocurrir la reacción y se las agregó al tubo 1 de la gradilla. Este procedimiento se debería haber repetido cada 30 segundos para los siguientes tubos hasta que la muestra adquiriera un color parduzco, sin embargo, ya en el tubo 1, al mezclarlo por inversión con un tapón de goma, se obtuvo una coloración parda. Como el efecto...