Bombardeo

ardeo
OBJETIVO
El alumno aprenderá la técnica de transformación genética en callos embriogénicos de maíz mediada por biobalística con el gen de la glicoproteína G y los genes gus y bar.MATERIALES Y MÉTODO

Tubos eppendorf
Puntas para 200 µl y para 50 µl
Swinex
Balas
Espermidina
Cloruro de calcio
Mallas en cloralex 100%
Medio de cultivo
10 disparos por construcción
VortexCámara de baja presión
Microcentrígua.


Preparación de partículas de Tungsteno

Se pesaron 60 mg de partículas de tungsteno y se colocaron en uno de los tubos de centrifuga de 15 ml, añadiendo 2 mlde HNO3 0.1 M y se sónico en hielo durante 20 minutos. Una vez transcurrido el tiempo se elimino el HNO3, se agregó 1 ml de agua desionizada estéril, transfiriendo la muestra a un tubo de 2 ml, sesónico brevemente.
El agua se elimino y se agregó 1 ml de etanol absoluto y se sónico nuevamente, centrifugando durante 30 segundos a 10,000 rpm. Después, se elimina el etanol y se agrega 1 ml de aguadesionizada estéril y se sónico nuevamente. Al finalizar, se coloco 750 μl de agua desionizada estéril a cada tubo eppendorf, almacenándolos a 20°C.

Preparación del ADN (Klein et al., 1988)

Enuno de los tubos eppendorff se coloco 50 μl de la suspensión de macropartículas de tungsteno, agregando después 5 μl de ADN, evitando que el ADN se mezcle con las partículas de tungsteno (lasolución de ADN se deposito en una de las paredes del tubo). Se agregó 50 μl de CaCL2 a 2.5 M, junto con 20 μl de espermidina 0.1 M, mezclándola con la gota de ADN (pipeteando), agitándola en vortex durante 5segundos (aproximadamente). Posterior al vortex, se centrifugo durante 5 a 10 segundos (en microcentrífuga a 13, 000 rpm). Al finalizar la cetrifuga, se elimino 100 μl del sobrenadante (laspartículas se resuspenden en el liquido remanente).

Para el bombardeo a los tejidos, se utilizo una cámara de baja presión a la cual esta conectada con una válvula a una bomba de presión y a un tanque...